ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

Summary

ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。

Abstract

ミツバチは世界中で生態学的および農業的に非常に重要ですが、ウイルス病原体への曝露を含むミツバチの健康に悪影響を及ぼすさまざまな圧力にもさらされています。このようなウイルスは、多種多様な壊滅的な影響を引き起こす可能性があり、実験的治療の効果を既存の背景感染から分離することを困難にする複数の要因のために、研究が困難な場合が多い。ここでは、大量のウイルス粒子を大量生産する方法と、ウイルス感染と効果をテストするためのハイスループットバイオアッセイを紹介します。連続したウイルスのないミツバチ細胞株の現在の欠如によって必要とされる、ウイルス粒子は、最小限のストレスの方法論を用いて巣箱から大量に抽出されるミツバチの蛹を用いて 生体内で 増幅される。これらのウイルス粒子は、その後、ミツバチケージバイオアッセイで、接種剤の生存率、ならびに栄養、農薬、および他の病原体との相互作用を含む様々な他のウイルス感染動態を試験することができる。このような粒子を使用する主な利点は、感染したミツバチの血リンパ液やホモジネートを介した感染などの現在の代替手段と比較して、その後の実験で未知の変数を導入する可能性を大幅に減らすことですが、バックグラウンドウイルス汚染を最小限に抑えるために、ミツバチを調達する際には注意が必要です。ケージアッセイは、コロニーレベルでウイルス感染効果をテストする大規模でフィールド現実的な実験に代わるものではなく、代わりに、半純粋なウイルス粒子と組み合わせて、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の様々な次元を調べるための重要なツールとして役立つベースラインウイルス応答を確立する方法として機能する。

Introduction

ミツバチ(Apis mellifera)は、現代の世界の農業景観において重要な役割を果たしていますが、現在、農薬曝露、飼料不足、寄生虫、病原体など、生物的および非生物的ストレッサーの組み合わせに苦しんでいます^1,2。懸念される最も重要な病原体の1つはウイルスであり、その多くは別の主要なミツバチストレッサーである寄生性Varroaダニ(Varroa destructor)によってベクター化されています。これらのウイルスは、繁殖期の生存率の低下、発達上の欠陥、および越冬期間の前後に完全な巣箱の崩壊につながる可能性のある麻痺を含む、ミツバチに一連の悪影響を引き起こす可能性があります^3,4,5。ウイルス感染^と戦うために使用される技術の開発には有望な進歩がありましたが、^6,7,8,9、多くのウイルスがミツバチやコロニー内で伝播、拡散、相互作用するダイナミクスはまだよく理解されていません^5,10.ミツバチとウイルスの相互作用の基本的な生物学と他の環境要因との関係を理解することは、効果的なウイルス管理技術を開発するために不可欠です。

しかし、ミツバチとウイルスの相互作用を研究することは、プロセスを複雑にする多数の既知および未知の要因を伴う課題を提起する。これらには、食事^11,12との相互作用、農薬曝露13、およびミツバチの遺伝的背景^14,15が含まれる。ウイルス感染のみに焦点を当てた場合でも、ミツバチの個体群(管理されたミツバチと野生の両方)は、急性症状を示さないことが多いが、常にある程度の背景ウイルス感染を有するため、合併症は一般的である^16,17、ウイルス共感染の影響はよく理解されていない¹⁸。これにより、ミツバチウイルスの影響の研究を解きほぐすことが難しくなっています。

多くのミツバチウイルス研究は、状況ウイルス感染を使用して他のストレッサーとの相互作用を探し、バックグラウンド感染が他の治療法とどのように変化するかを観察しています12,19,20,21。このアプローチは、重要な効果の同定、特に農薬や食事療法がウイルスのレベルと複製にどのように影響するかを発見することに成功していますが、既知の含有量と濃度のウイルス治療を接種することは、ウイルス感染ダイナミクスの実験的試験にとって重要です。それでも、実験的治療をバックグラウンド感染から分離することも課題を引き起こす可能性があります。フィールド研究では、研究者はミツバチからマルハナバチへのウイルス感染の証拠を提供するために、変形した翼ウイルス(DWV)の株を分化させました²²が、このアプローチを使用することはミツバチだけでは困難です。ウイルス感染性クローンは、感染の追跡23,24,25だけでなく、ミツバチウイルスの逆遺伝学研究やウイルス宿主相互作用研究^26,27,28のための強力なツール^です。しかし、ほとんどの場合、感染性クローンは、粒子を生成するために細胞内の感染サイクルを満たすために依然として必要とされる。このような粒子は、その感染力が裸のウイルスRNAよりも高く、かつ、キャプシドゲノムによる接種が自然感染を模倣するため、実験的処置のための接種剤として好ましい。

純粋で汚染されていないミツバチウイルス接種剤(野生型ウイルス株または感染性クローンに由来するもの)の生産も課題を提起する。これらは主に、純粋株ウイルス^29,30を産生するための信頼性が高く、連続的に複製され、ウイルスを含まないミツバチ細胞株を得ることの困難さによるものである。いくつかの細胞株が産生されているが、これらのシステムは不完全なままである。それでも、生存可能な細胞株²⁹を生産できるという希望があり、ウイルス産生と調査をより細かく制御できるようになるでしょう。このようなラインが広く利用可能になるまで、ほとんどのウイルス産生プロトコルは、インビボウイルス産生および精製の使用に依存し続けるであろう¹⁸、31^、32、^33、34。これらのアプローチには、目的のウイルス粒子を同定して精製すること(または感染性クローンを産生すること)と、それらを使用してミツバチ(通常は蛹として)に感染することが含まれる。蛹に標的ウイルスを注射し、次いで屠殺し、さらに粒子を抽出および精製する。しかし、そもそもウイルスのないミツバチはいないため、そのような濃縮物には他のウイルスの痕跡から常にある程度の汚染があるため、バックグラウンド感染の可能性が低いミツバチを選択する際には細心の注意を払わなければなりません。さらに、これらのプロトコル³³で使用するための櫛細胞から蛹を除去するための方法は、非常に労働集約的であり、ミツバチにストレスを誘発することができ、これらの手段¹⁸、³²によって産生を制限する。ここでは、ミツバチへの労力と機械的ストレスを少なくして幼虫を大規模に除去できる代替方法を報告する。

蛹が得られ、開始ウイルス接種剤を注射したら、ウイルスが複製する時間を提供するためにインキュベートされなければならない。その後、産生されたウイルス粒子は、実験ミツバチに感染するのに使用可能な形態に加工することができる。これを達成するためのいくつかの簡単な方法があり、感染源37としてウイルス感染したミツバチから生成された粗ホモジネート^35、36または血リンパ液を使用することを含む。これらの方法は有効であるが、バックグラウンド基板から未知の変数(例えば、死んだミツバチホモジネート中の他の因子)を導入する可能性が高くなる。さらに、実験で大量の既知の用量のウイルスを短時間で与える必要がある場合は、粒子を濃縮することが望ましい。したがって、より良好な制御のために、ウイルス粒子のある程度の精製および濃縮を可能にする方法を使用することが好ましい。一般に、一連の沈殿および遠心分離ステップは、ほとんどすべての可能な非標的ウイルス材料³³の除去をもたらすであろう。

この濃縮接種剤を製造した後、ウイルス力価(qPCR)を定量し、in vivoバイオアッセイでそれを特徴付けて、その生存率および死亡率を引き起こす能力をテストし、感染後に増加したウイルス力価が得られることを裏付けることが有益である。これは、注射実験(蛹または成虫のいずれか)または摂食実験(幼虫または成虫への)によって達成することができる。これらのアプローチはすべて可能ですが、ケージ内の成虫ミツバチのグループに餌をやることは、しばしば最速かつ最も簡単です。ケージアッセイ法は、農薬毒性³⁸、卵巣発生³⁹、および行動に対する栄養的影響^40,41を含むミツバチに対する様々な他の治療法の試験にも広く使用されており、したがって、ウイルス感染を他の因子⁴²と結びつける実験のための良好な基礎を形成することができる。

ここでは、ミツバチの労力と機械的ストレスを軽減する蛹を除去する方法や、ウイルス感染と影響をテストするための再現性の高いハイスループットバイオアッセイなど、高価な超遠心分離機を使用せずに大量の半純粋で高濃縮のウイルス粒子を製造するための信頼性の高い方法について説明します。ウイルス接種剤の純度を厳密に制御することにより、研究者は他のウイルス接種方法と比較してミツバチウイルス応答の変動を低減することができる。さらに、バイオアッセイは、現場で現実的な設定にスケーリングする前に、再現性の高い実験ユニットを使用して小グループレベルでウイルス効果をスクリーニングすることができ、これは管理にはるかに労力がかかります。これら2つの方法を組み合わせることで、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の全体的な理解を深めるのに役立つ研究に必要なツールを提供します。

Protocol

1.ミツバチの大量抽出オプション1:幼虫の自己除去 ミツバチの女王を空っぽのラングストロスのフレームに檻に入れ、コロニーに戻す。女王がこのフレームに24時間卵を産むのを許してください。 24時間後にフレームをチェックして、ほとんどの櫛細胞に新しく産まれた卵が含まれていることを確認してください。女王とコロニーによっては、卵は最初の24時間であまりうまく産?…

Representative Results

蛹注射とウイルス抽出のプロトコル(図1)に首尾よく従うと、大量のウイルス粒子が生成されます。しかし、さまざまなコロニーから供給された蛹を複数の時点でサンプリングして注入することで、汚染の少ない標的ウイルスを獲得する可能性が最大化されます。ミツバチの中でウイルスが複製し、互いに相互作用するダイナミクスはよく理解されていません。既存の感染の可能?…

Discussion

ここでは、幼虫の収集、ウイルスの繁殖、抽出、濃縮、ならびにケージ給餌実験の形でのウイルス処理を含む、ウイルス増幅および接種剤ストック調製プロセスのすべてのステップを詳述する方法を概説した。これらの方法は、半純粋なウイルス粒子の生成を可能にし(図4)、その有効性は、成人にとって致死的であるウイルスの用量反応死亡率試験によって一貫して定?…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375