Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Summary

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Abstract

Honigbienen sind weltweit von großer ökologischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, unterliegen aber auch einer Vielzahl von Belastungen, die sich negativ auf die Bienengesundheit auswirken, einschließlich der Exposition gegenüber viralen Krankheitserregern. Solche Viren können eine Vielzahl von verheerenden Auswirkungen verursachen und können aufgrund mehrerer Faktoren, die es schwierig machen, die Auswirkungen experimenteller Behandlungen von einer bereits bestehenden Hintergrundinfektion zu trennen, oft schwierig zu untersuchen sein. Hier stellen wir eine Methode zur Massenproduktion großer Mengen von Viruspartikeln zusammen mit einem Hochdurchsatz-Bioassay vor, um Virusinfektionen und -effekte zu testen. Aufgrund des derzeitigen Fehlens einer kontinuierlichen, virusfreien Honigbienenzelllinie werden die Viruspartikel in vivo mit Honigbienenpuppen verstärkt, die mit einer minimal-stressigen Methodik in großen Mengen aus dem Bienenstock extrahiert werden. Diese Viruspartikel können dann in Bioassays für Honigbienenkäfige verwendet werden, um die Inokula-Lebensfähigkeit sowie verschiedene andere Virusinfektionsdynamiken zu testen, einschließlich Wechselwirkungen mit Ernährung, Pestiziden und anderen Krankheitserregern. Ein großer Vorteil der Verwendung solcher Partikel besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, unbekannte Variablen in nachfolgende Experimente einzuführen, im Vergleich zu aktuellen Alternativen, wie z. B. einer Infektion über infizierte Bienenhämolymphe oder Homogenat, erheblich verringert wird, obwohl bei der Beschaffung der Bienen immer noch darauf geachtet werden sollte, die Kontamination mit Hintergrundviren zu minimieren. Die Käfigassays sind kein Ersatz für groß angelegte, feldrealistische Experimente, die die Auswirkungen von Virusinfektionen auf Kolonieebene testen, sondern dienen stattdessen als Methode zur Etablierung grundlegender viraler Reaktionen, die in Kombination mit den halbreinen Viruspartikeln als wichtige Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Dimensionen der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus dienen können.

Introduction

Honigbienen (Apis mellifera) spielen eine entscheidende Rolle in der modernen globalen Agrarlandschaft, leiden aber derzeit unter einer Kombination aus biotischen und abiotischen Stressfaktoren, einschließlich Pestizidbelastung, schlechtem Futter, Parasiten und Krankheitserregern ^1,2. Einer der wichtigsten Krankheitserreger sind Viren, von denen viele von einem anderen der wichtigsten Honigbienenstressoren, der parasitären Varroa-Milbe (Varroa destructor), übertragen werden. Diese Viren können eine Reihe von negativen Auswirkungen bei Honigbienen verursachen, darunter ein vermindertes Brutüberleben, Entwicklungsdefekte und Lähmungen, die sowohl vor als auch nach Überwinterungsperioden zu einem totalen Bienenstockkollaps führen^können 3,4,5. Obwohl es vielversprechende Fortschritte bei der Entwicklung von Technologien zur Bekämpfung von Virusinfektionen gegeben hat 6,7,8,9, ist die Dynamik, durch die sich viele Viren innerhalb einer Honigbiene oder eines Honigvolkes ausbreiten, verbreiten und interagieren, immer noch wenig verstanden ^5,10 . Das Verständnis der grundlegenden Biologie von Honigbienen- und Virusinteraktionen und ihrer Beziehungen zu anderen Umweltfaktoren ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Virusmanagementtechniken.

Die Untersuchung von Honigbienen-Virus-Interaktionen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da zahlreiche bekannte und unbekannte Faktoren den Prozess erschweren. Dazu gehören Wechselwirkungen mit der Ernährung 11,12, die Pestizidbelastung 13 und der genetische Hintergrund^{der Bienen 14,15}. Selbst wenn man sich nur auf die Virusinfektion konzentriert, sind Komplikationen häufig, da Honigbienenpopulationen, sowohl verwaltete als auch wilde, immer ein gewisses Maß an Hintergrundvirusinfektion aufweisen, wenn auch oft ohne akute Symptome zu manifestieren^16,17, und die Auswirkungen der Viruskoinfektion sind nicht gut verstanden ¹⁸. Dies hat es schwierig gemacht, die Auswirkungen des Honigbienenvirus zu entwirren.

Viele Honigbienenvirusstudien haben Indizienvirusinfektionen verwendet, um nach Wechselwirkungen mit anderen Stressfaktoren zu suchen und zu beobachten, wie sich Hintergrundinfektionen mit anderen Behandlungen^{ändern 12,19,20,21}. Während dieser Ansatz erfolgreich bei der Identifizierung wichtiger Effekte war, insbesondere bei der Entdeckung, wie sich Pestizide oder diätetische Behandlungen auf das Virusniveau und die Replikation auswirken, ist die Inokulation mit einer Virusbehandlung mit bekanntem Inhalt und bekannter Konzentration entscheidend für experimentelle Tests der Virusinfektionsdynamik. Dennoch kann die Trennung der experimentellen Behandlung von der Hintergrundinfektion auch Herausforderungen mit sich bringen. In Feldstudien haben Forscher Stämme des deformierten Flügelvirus (DWV) differenziert, um Beweise für die Virusübertragung von Honigbienen auf Hummeln²² zu liefern, aber die Verwendung dieses Ansatzes wäre bei Honigbienen allein schwierig. Virusinfektiöse Klone sind ein leistungsfähiges Werkzeug, nicht nur für die Verfolgung von Infektionen 23,24,25, sondern auch für umgekehrte genetische Studien von Honigbienenviren und für die Virus-Wirt-Interaktionsforschung^26,27,28. In den meisten Fällen sind jedoch immer noch infektiöse Klone erforderlich, um den Infektionszyklus in Zellen zu erfüllen, um Partikel zu produzieren. Solche Partikel werden als Impfmittel für experimentelle Behandlungen bevorzugt, da ihre Infektiosität höher ist als die nackte virale RNA und die Impfung mit verkapselten Genomen eine natürliche Infektion nachahmt.

Die Produktion von reinen, nicht kontaminierten Honigbienenvirus-Inokula (Wildtyp-Virusstämme oder solche, die von infektiösen Klonen stammen) stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Diese sind in erster Linie auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, eine zuverlässige, kontinuierlich replizierende, virusfreie Honigbienenzelllinie zur Herstellung von Reinstammviren zu erhalten^29,30. Während einige Zelllinien produziert wurden, bleiben diese Systeme unvollkommen; Dennoch besteht die Hoffnung, dass eine lebensfähige Zelllinie produziert werden^{kann 29}, die eine feinere Kontrolle der Virusproduktion und -untersuchung ermöglichen würde. Bis eine solche Linie allgemein verfügbar ist, werden die meisten Virenproduktionsprotokolle weiterhin auf die Verwendung von In-vivo-Virusproduktion und -reinigung angewiesen sein 18,31,32,33,34. Diese Ansätze beinhalten die Identifizierung und Reinigung von Viruspartikeln von Interesse (oder die Herstellung eines infektiösen Klons) und deren Verwendung zur Infektion von Honigbienen, normalerweise als Puppen. Die Puppen werden mit dem Zielvirus injiziert und dann geopfert, und weitere Partikel werden extrahiert und gereinigt. Da jedoch keine Bienen von vornherein virenfrei sind, gibt es immer ein gewisses Maß an Kontamination durch Spuren anderer Viren in einem solchen Konzentrat, und daher muss bei der Auswahl von Bienen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von Hintergrundinfektionen große Sorgfalt angewendet werden. Darüber hinaus sind Methoden zur Entfernung der Puppen aus den Kammzellen zur Verwendung in diesen Protokollen 33 sehr arbeitsintensiv und können Stress bei den Bienen auslösen, wodurch die Produktion auf diese Weise begrenzt^{wird 18,32}. Hier berichten wir über eine alternative Methode, die eine großflächige Entfernung von Larven mit wenig Arbeit und weniger mechanischer Belastung der Bienen ermöglicht.

Sobald Puppen erhalten und mit dem Startvirus-Inokulum injiziert wurden, müssen sie inkubiert werden, um dem Virus Zeit zu geben, sich zu replizieren. Anschließend können produzierte Viruspartikel zu einer Form verarbeitet werden, die zur Infektion experimenteller Bienen verwendet werden kann. Es gibt mehrere einfache Methoden, um dies zu erreichen, einschließlich der Verwendung eines rohen Homogenats 35,36 oder Hämolymph^, das von viral infizierten Bienen als Infektionsquelle erzeugt^{wird 37}. Diese Methoden sind effektiv, haben aber eine größere Chance, unbekannte Variablen aus dem Hintergrundsubstrat einzuführen (z. B. andere Faktoren in den toten Bienenhomogenaten). Darüber hinaus ist es wünschenswert, die Partikel zu konzentrieren, wenn ein Experiment eine große, bekannte Dosis eines Virus in kurzer Zeit erfordert. Daher ist es für eine bessere Kontrolle vorzuziehen, Methoden zu verwenden, die ein gewisses Maß an Reinigung und Konzentration der Viruspartikel ermöglichen. Im Allgemeinen führt eine Reihe von Fällungs- und Zentrifugationsschritten zur Entfernung fast aller möglichen Nichtzielvirenmaterialien³³.

Nach der Herstellung dieses konzentrierten Inokulums ist es vorteilhaft, die viralen Titer (qPCR) zu quantifizieren und mit In-vivo-Bioassays zu charakterisieren, um ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit, Mortalität zu verursachen, zu testen und zu bestätigen, dass nach der Infektion erhöhte Virustiter erhalten werden. Dies kann durch Injektionsexperimente (entweder in Puppen oder Erwachsene) oder Fütterungsexperimente (in Larven oder Erwachsene) erreicht werden. Während all diese Ansätze möglich sind, ist die Fütterung von Gruppen erwachsener Bienen in einem Käfig oft die schnellste und einfachste. Die Käfiguntersuchungsmethode wird auch häufig zum Testen verschiedener anderer Behandlungen an Bienen verwendet, einschließlich Pestizidtoxizität³⁸, Eierstockentwicklung³⁹ und Ernährungseinfluss auf das Verhalten 40,41 und kann daher eine gute Grundlage für Experimente bilden^, die eine Virusinfektion mit anderen Faktoren^{verbinden 42.}

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Herstellung großer Mengen halbreiner, hochangereicherter Viruspartikel ohne Verwendung einer teuren Ultrazentrifuge, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Puppen, die den Arbeitsaufwand und die mechanische Belastung der Bienen reduziert, und eines hochgradig wiederholbaren Hochdurchsatz-Bioassays zum Testen von Virusinfektionen und -wirkungen. Durch die strenge Kontrolle der Reinheit der viralen Impfung sind die Forscher in der Lage, die Variation der Virusreaktion von Honigbienen im Vergleich zu anderen viralen Impfmethoden zu reduzieren. Darüber hinaus kann der Bioassay auf der Ebene kleiner Gruppen mit hochgradig wiederholbaren experimentellen Einheiten nach viralen Effekten suchen, bevor er auf feldrealistische Einstellungen skaliert wird, was weitaus arbeitsintensiver zu handhaben ist. In Kombination bieten diese beiden Methoden die notwendigen Werkzeuge für Studien, die dazu beitragen können, unser allgemeines Verständnis der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus zu verbessern.

Protocol

1. Massenbienenextraktionsoption 1: Selbstentfernung der Larven Käfig einer Honigbienenkönigin auf einem leeren, langgezogenen Langstroth-Rahmen und bringen Sie sie in ihre Kolonie zurück. Lassen Sie die Königin 24 Stunden lang Eier auf diesen Rahmen legen. Überprüfen Sie den Rahmen nach 24 Stunden, um sicherzustellen, dass die meisten Kammzellen neu gelegte Eier enthalten. Je nach Königin und Kolonie werden Eier in den ersten 24 h manchmal nicht sehr gut gelegt. In diesem Fall sollten Sie zusät…

Representative Results

Die erfolgreiche Befolgung der Protokolle (Abbildungen 1) für die Puppeninjektion und die Virusextraktion sollte große Mengen an Viruspartikeln erzeugen. Die Probenahme und Injektion von Puppen, die zu mehreren Zeitpunkten aus einer Vielzahl von Kolonien stammen, maximiert jedoch die Chancen, Zielviren mit geringer Kontamination zu erwerben. Die Dynamik, durch die sich Viren innerhalb einer Honigbiene replizieren und miteinander interagieren, ist nicht gut verstanden; In Verbindung mit der Wahrscheinli…

Discussion

Hier haben wir Methoden beschrieben, die jeden Schritt der Virusamplifikation und des Impfbestandsvorbereitungsprozesses detailliert beschreiben, einschließlich der Larvensammlung und Virusvermehrung, -extraktion und -konzentration sowie der Virusbehandlung in Form von Käfigfütterungsexperimenten. Diese Methoden ermöglichen die Herstellung von halbreinen Viruspartikeln (Abbildung 4), deren Wirksamkeit durch Dosis-Wirkungs-Mortalitätstests für Viren, die für Erwachsene tödlich sind, k…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375