꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)
Summary
여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.
Abstract
꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.
Introduction
꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지 않습니다 5,10 . 꿀벌과 바이러스 상호 작용의 기본 생물학과 다른 환경 요인과의 관계를 이해하는 것은 효과적인 바이러스 관리 기술을 개발하는 데 중요합니다.
그러나 꿀벌 – 바이러스 상호 작용을 연구하는 것은 과정을 복잡하게 만드는 수많은 알려진 요인과 알려지지 않은 요인으로 인해 어려움을 겪습니다. 여기에는 식이요법 11,12, 살충제 노출(13), 꿀벌 유전적 배경(14,15)과의 상호작용이 포함된다. 바이러스 감염에만 초점을 맞출 때조차도, 꿀벌 개체군은 관리되고 야생이기 때문에 합병증이 흔합니다.하지만 종종 급성 증상을 나타내지 않고 바이러스 16,17 및바이러스 공동 감염의 효과는 잘 이해되지 않습니다 18. 이로 인해 꿀벌 바이러스 효과에 대한 연구가 풀리기 어려워졌습니다.
많은 꿀벌 바이러스 연구는 상황 바이러스 감염을 사용하여 다른 스트레스 요인과의 상호 작용을 찾아 배경 감염이 다른 치료법12,19,20,21과 어떻게 변하는지 관찰했습니다. 이 접근법은 중요한 효과, 특히 살충제 또는식이 요법이 바이러스 수준과 복제에 어떻게 영향을 미치는지 발견하는 데 성공했지만 알려진 함량과 농도의 바이러스 처리 접종은 바이러스 감염 역학의 실험적 테스트에 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실험적 치료를 배경 감염과 분리하는 것도 어려움을 초래할 수 있습니다. 현장 연구에서 연구자들은 꿀벌에서 꿀벌22로 바이러스가 전염되는 증거를 제공하기 위해 변형 된 날개 바이러스 (DWV)의 균주를 차별화했지만이 접근법을 사용하는 것은 꿀벌만으로는 어려울 것입니다. 바이러스 감염성 클론은 감염 23,24,25을 추적하는 것뿐만 아니라 꿀벌 바이러스의 역 유전학 연구 및 바이러스 – 숙주 상호 작용 연구 26,27,28을위한 강력한 도구입니다. 그러나 대부분의 경우, 감염성 클론은 입자를 생산하기 위해 세포 내부의 감염주기를 충족시켜야합니다. 이러한 입자는 그들의 감염성이 네이키드 바이러스 RNA보다 높고 캡슐화된 게놈을 사용한 접종이 자연 감염을 모방하기 때문에 실험적 치료를 위한 접종물로서 바람직하다.
오염되지 않은 순수 꿀벌 바이러스 접종물 (야생형 바이러스 균주 또는 감염성 클론에서 유래 한 균주)의 생산은 또한 도전을 제기합니다. 이들은 주로 순수 균주 바이러스29,30을 생산하기 위해 신뢰할 수 있고, 지속적으로 복제되는, 바이러스가 없는 꿀벌 세포주를 수득하는데 어려움 때문이다. 일부 세포주가 생산되었지만, 이러한 시스템은 불완전한 상태로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 생존 가능한 세포주가29 개 생산되어 바이러스 생산 및 조사를보다 세밀하게 제어 할 수 있기를 희망합니다. 이러한 라인이 널리 이용가능해질 때까지, 대부분의 바이러스 생산 프로토콜은 생체내 바이러스 생산 및 정제(18,31,32,33,34)의 사용에 계속 의존할 것이다. 이러한 접근법에는 관심있는 바이러스 입자를 확인하고 정화 (또는 전염성 클론을 생산)하고이를 사용하여 꿀벌, 보통 번데기와 같은 꿀벌을 감염시키는 것이 포함됩니다. 번데기는 표적 바이러스와 함께 주입 된 다음 희생되고 더 많은 입자가 추출되고 정제됩니다. 그러나 처음에는 바이러스가없는 꿀벌이 없기 때문에 그러한 농축액에서 다른 바이러스의 흔적으로 인해 어느 정도 오염이 항상 발생하므로 배경 감염 가능성이 낮은 꿀벌을 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 또한, 이들 프로토콜(33)에 사용하기 위해 빗 세포로부터 번데기를 제거하는 방법은 매우 노동 집약적이며 꿀벌에서 스트레스를 유도할 수 있으며, 이러한 수단(18,32)에 의해 생산을 제한한다. 여기에서, 우리는 꿀벌에 대한 노동이 거의없고 기계적 스트레스가 적고 애벌레를 대규모로 제거 할 수있는 대체 방법을보고합니다.
번데기를 얻고 시작 바이러스 접종물과 함께 주입하면 바이러스가 복제 할 시간을 제공하기 위해 배양되어야합니다. 이어서, 생산된 바이러스 입자는 실험용 꿀벌을 감염시키는 데 사용할 수 있는 형태로 가공될 수 있다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 간단한 방법들이 있는데, 여기에는 바이러스적으로 감염된 꿀벌로부터 생성된 조질 균질액(35,36) 또는 용혈림프(37)를 감염원으로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 효과적이지만 배경 기질로부터 알려지지 않은 변수 (예 : 죽은 벌 균질물의 다른 요인)를 도입 할 가능성이 더 큽니다. 또한, 실험이 단기간에 바이러스의 크고 알려진 복용량을 제공해야하는 경우 입자를 집중시키는 것이 바람직합니다. 따라서, 보다 나은 제어를 위해, 바이러스 입자의 어느 정도의 정제 및 농축을 허용하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 일련의 침전 및 원심분리 단계는 거의 모든 가능한 비표적 바이러스 물질(33)의 제거를 초래할 것이다.
이 농축 접종물을 생산 한 후, 바이러스 역가 (qPCR)를 정량화하고 생체 내 생물 분석법으로 특성화하여 생존력과 사망률을 유발하는 능력을 테스트 할뿐만 아니라 감염 후 증가 된 바이러스 역가가 얻어진다는 것을 확증하는 것이 유익합니다. 이것은 주사 실험 (번데기 또는 성인으로) 또는 먹이 실험 (애벌레 또는 성인에게)을 통해 달성 될 수 있습니다. 이러한 모든 접근법이 가능하지만 새장에있는 성인 꿀벌 그룹에 먹이를주는 것이 종종 가장 빠르고 간단합니다. 케이지 분석 방법은 또한 살충제 독성38, 난소 발달39 및 행동40,41에 대한 영양 영향을 포함하여 꿀벌에 대한 다양한 다른 치료법을 테스트하는 데 널리 사용되므로 바이러스 감염과 다른 요인(42)을 연결하는 실험을위한 좋은 기초를 형성 할 수 있습니다.
여기서는 꿀벌에 대한 노동 및 기계적 스트레스를 줄이는 번데기를 제거하는 방법과 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기위한 반복성이 높고 처리량이 높은 생물 분석을 포함하여 값 비싼 초원심분리기를 사용하지 않고 대량의 반 순수하고 고농축 바이러스 입자를 생산하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 바이러스 접종의 순도를 엄격하게 조절함으로써 조사관은 다른 바이러스 접종 방법에 비해 꿀벌 바이러스 반응의 변화를 줄일 수 있습니다. 또한, 생물 분석은 현장 현실적인 설정으로 확장하기 전에 매우 반복 가능한 실험 단위를 사용하여 소그룹 수준에서 바이러스 효과를 스크리닝 할 수 있으며, 이는 관리하기에 훨씬 더 노동 집약적입니다. 이 두 가지 방법이 결합되어 꿀벌 – 바이러스 생리 학적 상호 작용에 대한 전반적인 이해를 향상시키는 데 도움이되는 연구에 필요한 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
프로토콜 생성 과정에서 그녀의 아이디어와 토론에 대한 줄리아 파인 박사와 편집 전반에 걸쳐 도움이되는 의견을 주신 Cassondra Vernier 박사에게 감사드립니다. 이 자료들은 보조금 ID 549025에 따라 식량 농업 연구 재단이 부분적으로 지원하는 프로젝트에 기여했습니다.
Materials
| 10% bleach solution | |||
| 24:1 chloroform:isoamyl alcohol | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% ethanol solution | |||
| Cages for bioassay | Dependent on experimental setup | ||
| Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | Optional (if no injector appartus is available) |
| Containers for larval self-removal | Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions) | ||
| Forceps | Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision | ||
| Fume hood | |||
| Incubator | Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | Any absorbent wipe will work |
| Medium-sized weight boats | Serve as inoculum trays | ||
| Microcon-100kDa with Biomax membrane | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| Nitrile gloves | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | Capable of 15,000 x g | ||
| Refrigerated centrifuge | Capable of 21,000 x g | ||
| Repeater M4 Multipipette | Eppendorf | 4982000322 | Optional (if no injector appartus is available) |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| RNAse-free water | SigmaAldrich | W4502 | |
| Sucrose | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
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