Fremstilling av virusberiket inokulum for oral infeksjon av honningbier (Apis mellifera)

Summary

Her beskriver vi to protokoller: først å forplante, trekke ut, rense og kvantifisere store mengder honningbi ikke-innhyllede viruspartikler, inkludert en metode for å fjerne honningbi-pupper og for det andre for å teste effekten av virusinfeksjon ved hjelp av en svært repeterbar, høygjennomstrømningsburbioassay.

Abstract

Honningbier er av stor økologisk og landbruksmessig betydning rundt om i verden, men er også utsatt for en rekke trykk som påvirker biehelsen negativt, inkludert eksponering for virale patogener. Slike virus kan forårsake et bredt spekter av ødeleggende effekter og kan ofte være utfordrende å studere på grunn av flere faktorer som gjør det vanskelig å skille effekten av eksperimentelle behandlinger fra eksisterende bakgrunnsinfeksjon. Her presenterer vi en metode for å masseprodusere store mengder viruspartikler sammen med en bioassay med høy gjennomstrømning for å teste virusinfeksjon og effekter. Nødvendiggjort av dagens mangel på en kontinuerlig, virusfri honningbicellelinje, forsterkes virale partikler in vivo ved hjelp av honningbipupp, som ekstraheres fra bikube i store mengder ved hjelp av minimal stressende metodikk. Disse viruspartiklene kan deretter brukes i honningbiburbioassays for å teste inokulær levedyktighet, samt ulike andre virusinfeksjonsdynamikker, inkludert interaksjoner med ernæring, plantevernmidler og andre patogener. En stor fordel med å bruke slike partikler er at det i stor grad reduserer sjansene for å introdusere ukjente variabler i etterfølgende eksperimentering sammenlignet med nåværende alternativer, for eksempel infeksjon via infisert bi hemolymfe eller homogenat, selv om det fortsatt bør tas hensyn når du kjøper biene, for å minimere bakgrunnsvirusforurensning. Merdanalysene er ikke en erstatning for store, feltrealistiske eksperimenter som tester virusinfeksjonseffekter på koloninivå, men fungerer i stedet som en metode for å etablere grunnleggende virale responser som i kombinasjon med de semi-rene viruspartiklene kan tjene som viktige verktøy for å undersøke ulike dimensjoner av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.

Introduction

Honningbier (Apis mellifera) spiller en kritisk rolle i det moderne globale landbrukslandskapet, men lider for tiden av en kombinasjon av biotiske og abiotiske stressfaktorer, inkludert eksponering for plantevernmidler, dårlig fôr, parasitter og patogener ^1,2. En av de viktigste patogenene av bekymring er virus, hvorav mange er vektorisert av en annen av de store honningbistressorene, den parasittiske Varroa-myten (Varroa destructor). Disse virusene kan forårsake en rekke negative effekter hos honningbier, inkludert redusert brødoverlevelse, utviklingsfeil og lammelse som kan føre til total bikubekollaps både før og etter overvintringsperioder ^3,4,5. Selv om det har vært lovende fremskritt i utviklingen av teknologier som brukes til å bekjempe virusinfeksjon 6,7,8,9, dynamikken som mange virus forplanter, sprer seg og samhandler innenfor en honningbi eller koloni er fortsatt dårlig forstått ^5,10 . Å forstå den grunnleggende biologien til honningbi og virusinteraksjoner og deres forhold til andre miljøfaktorer er avgjørende for å utvikle effektive virushåndteringsteknikker.

Studier av honningbi-virusinteraksjoner gir imidlertid utfordringer med mange kjente og ukjente faktorer som kompliserer prosessen. Disse inkluderer interaksjoner med diett ^11,12, pesticid eksponering¹³, og bi genetisk bakgrunn^14,15. Selv når du fokuserer på virusinfeksjon alene, er komplikasjoner vanlige fordi honningbipopulasjoner, både administrerte og ville, alltid har en viss grad av bakgrunnsvirusinfeksjon, men ofte uten å manifestere akutte symptomer^16,17, og effekten av virusmyntfeksjon er ikke godt forstått¹⁸. Dette har gjort studiet av honningbiviruseffekter vanskelig å disentangle.

Mange honningbivirusstudier har brukt indisier for å se etter interaksjoner med andre stressfaktorer, og observerer hvordan bakgrunnsinfeksjoner endres med andre behandlinger 12,19,20,21. Selv om denne tilnærmingen har vært vellykket med å identifisere viktige effekter, spesielt å oppdage hvordan plantevernmidler eller kostholdsbehandlinger påvirker virusnivåer og replikasjon, er inokulasjon med virusbehandling av kjent innhold og konsentrasjon avgjørende for eksperimentell testing av virusinfeksjonsdynamikk. Likevel kan det å skille eksperimentell behandling fra bakgrunnsinfeksjon også by på utfordringer. I feltstudier har forskere differensiert stammer av deformert vingevirus (DWV) for å gi bevis for virusoverføring fra honningbier til humlebier²², men å bruke denne tilnærmingen ville være vanskelig i honningbier alene. Virus smittsomme kloner er et kraftig verktøy, ikke bare for å spore infeksjon ^23,24,25 men for omvendte genetikk studier av honning bie virus og for virus-vert interaksjon forskning 26,27,28. Men i de fleste tilfeller er smittsomme kloner fortsatt pålagt å oppfylle infeksjonssyklusen inne i celler for å produsere partikler. Slike partikler foretrekkes som inocula for eksperimentelle behandlinger fordi deres infektivitet er høyere enn den nakne virale RNA og inokulasjon med innkapslede genomer etterligner en naturlig infeksjon.

Produksjonen av rene, ukontaminerte honningbivirus inocula (villtype virusstammer eller de som er avledet fra smittsomme kloner) gir også utfordringer. Disse skyldes hovedsakelig vanskelighetene med å skaffe en pålitelig, kontinuerlig replikerende, virusfri honningbicellelinje for å produsere renstammevirus^29,30. Mens noen cellelinjer er produsert, forblir disse systemene ufullkomne; Likevel er det håp om at en levedyktig cellelinje kan produseres²⁹, noe som vil gi bedre kontroll over virusproduksjon og undersøkelse. Inntil en slik linje blir allment tilgjengelig, vil de fleste virusproduksjonsprotokoller fortsette å stole på bruk av in vivo virusproduksjon og rensing 18,31,32,33,34. Disse tilnærmingene innebærer å identifisere og rense viruspartikler av interesse (eller produsere en smittsom klone) og bruke dem til å infisere honningbier, vanligvis som pupper. Puppen injiseres med målviruset og ofres deretter, og ytterligere partikler ekstraheres og renses. Men fordi ingen bier er virusfrie til å begynne med, er det alltid en viss grad av forurensning fra spor av andre virus i noe slikt konsentrat, og derfor må det tas stor forsiktighet ved valg av bier med lav sannsynlighet for bakgrunnsinfeksjoner. Videre er metoder for å fjerne puppene fra kamcellene for bruk i disse protokollene³³ svært arbeidskrevende og kan indusere stress i biene, noe som begrenser produksjonen med disse midlene^18,32. Her rapporterer vi en alternativ metode som muliggjør storskala fjerning av larver med lite arbeidskraft og mindre mekanisk stress på biene.

Når pupper er oppnådd og injisert med startviruset inoculum, må de inkuberes for å gi viruset tid til å replikere. Deretter kan produserte viruspartikler behandles i en form som kan brukes til å infisere eksperimentelle bier. Det finnes flere enkle metoder for å oppnå dette, inkludert å bruke en rå homogenat^35,36 eller hemolymfe generert fra viralt infiserte bier som en kilde til infeksjon³⁷. Disse metodene er effektive, men har større sjanse for å introdusere ukjente variabler fra bakgrunnssubstratet (f.eks. andre faktorer i de døde bi-homogenatene). I tillegg er det ønskelig å konsentrere partiklene hvis et eksperiment krever å gi en stor, kjent dose av et virus på kort tid. Derfor, for bedre kontroll, er det å foretrekke å bruke metoder som tillater et visst nivå av rensing og konsentrasjon av viruspartiklene. Generelt vil en rekke nedbørs- og sentrifugeringstrinn føre til fjerning av nesten alt mulig ikke-målvirusmateriale³³.

Etter å ha produsert dette konsentrerte inokulumet, er det gunstig å kvantifisere virale titere (qPCR) og karakterisere det med in vivo bioassays for å teste sin levedyktighet og evne til å forårsake dødelighet, samt å bekrefte at økte virustitre oppnås etter infeksjon. Dette kan oppnås gjennom injeksjonseksperimenter (enten i pupper eller voksne) eller fôringseksperimenter (i larver eller voksne). Mens alle disse tilnærmingene er mulige, er fôring til grupper av voksne bier i et bur ofte den raskeste og enkleste. Buranalysemetoden er også mye brukt til å teste ulike andre behandlinger på bier, inkludert pesticidtoksisitet³⁸, eggstokkutvikling³⁹ og ernæringsmessig påvirkning på atferd^40,41 og kan derfor danne et godt grunnlag for eksperimenter som knytter virusinfeksjon med andre faktorer⁴².

Her beskriver vi en pålitelig metode for å produsere store mengder halvrent, svært beriket viruspartikler uten å bruke en dyr ultracentrifuge, inkludert en metode for å fjerne pupper som reduserer arbeidskraft og mekanisk stress på biene og en svært repeterbar bioassay med høy gjennomstrømning for testing av virusinfeksjon og effekter. Ved å kontrollere renheten til viral inocula tett, kan etterforskere redusere variasjonen i honningbi viral respons i forhold til andre virale inokulasjonsmetoder. Videre kan bioassay screene for viruseffekter på et lite gruppenivå ved hjelp av svært repeterbare eksperimentelle enheter før skalering til feltrealistiske innstillinger, noe som er langt mer arbeidskrevende å administrere. I kombinasjon gir disse to metodene de nødvendige verktøyene for studier som kan bidra til å forbedre vår generelle forståelse av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.

Protocol

1. Masse bie ekstraksjon alternativ 1: larval selvfjerning Bur en honningbidronning på en tom, trukket Langstroth-ramme og returner henne til kolonien. La dronningen legge egg på denne rammen i 24 timer. Kontroller rammen etter 24 timer for å sikre at de fleste kamcellene inneholder nylagte egg. Avhengig av dronningen og kolonien, legges egg noen ganger ikke veldig bra i de første 24 timer. Hvis dette skjer, la det gå ytterligere 24 timer og juster tiden etter behov. Etter 24 …

Representative Results

Vellykket etter protokollene (figur 1) for pupal injeksjon og viral ekstraksjon bør produsere store mengder viruspartikler. Prøvetaking og injeksjon av pupper hentet fra en rekke kolonier på flere tidspunkter maksimerer imidlertid sjansene for å skaffe seg målvirus med lav forurensning. Dynamikken som virus replikerer og samhandler med hverandre i en honningbi, er ikke godt forstått; kombinert med sannsynligheten for preeksisterer infeksjon, er det ingen garanti for at det injiserte (ønskede) viru…

Discussion

Her har vi skissert metoder som beskriver hvert trinn i virusforsterkning og inokulumbestandsforberedelsesprosess, inkludert larversamling og virusutbredelse, ekstraksjon og konsentrasjon, samt virusbehandling i form av burfôringseksperimenter. Disse metodene muliggjør produksjon av halvriske viruspartikler (figur 4), hvis effektivitet konsekvent kan kvantifiseres ved doseresponsdødelighetstesting for virus som er dødelige for voksne (figur 5). Etter bekreft…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375