Un modelo ortotópico de ratón reseccional de cáncer de páncreas
Summary
En el contexto clínico, los pacientes con cáncer de páncreas localizado se someterán a pancreatectomía seguida de tratamiento adyuvante. Este protocolo divulgado aquí apunta establecer un método seguro y de manera efectiva de modelar este escenario clínico en ratones desnudos, con la implantación orthotopic del cáncer pancreático seguido por pancreatectomy y splenectomy distales.
Abstract
Hay una carencia de modelos animales satisfactorios para estudiar terapia ayudante y/o neoadjuvant en los pacientes que son considerados para la cirugía del cáncer pancreático (PC). Para tratar esta deficiencia, describimos un modelo del ratón que implica la implantación orthotopic de la PC seguida por pancreatectomy y el splenectomy distales. Se ha demostrado que el modelo es seguro y convenientemente flexible para el estudio de diversos enfoques terapéuticos en entornos adyuvante y neoadyuvante.
En este modelo, un tumor pancreático primero es generado implantando una mezcla de células cancerosas pancreáticas humanas (luciferasa-marcada AsPC-1) y de células radiadas pancreáticas asociadas cáncer humano en el páncreas distal de los ratones desnudos athymic de Balb/c. Después de tres semanas, el cáncer es resecado por re-laparotomía, pancreatectomía distal y esplenectomía. En este modelo, las imágenes de bioluminiscencia se pueden utilizar para seguir el progreso del desarrollo del cáncer y los efectos de la resección/tratamientos. Después de la resección, se puede administrar terapia adyuvante. Alternativamente, el tratamiento neoadyuvante se puede dar antes de la resección.
Los datos representativos a partir de 45 ratones se presentan. Todos los ratones experimentaron pancreatectomy/splenectomy distal acertado sin las ediciones del hemostasis. Un margen pancreático próximo macroscópico mayor de 5 milímetros fue alcanzado en 43 (el 96%) ratón. El índice de éxito técnico de la resección pancreática era el 100%, con la mortalidad y la morbosidad tempranas del 0%. Ningunos de los animales murieron durante la semana después de la resección.
En resumen, describimos una técnica robusta y reproducible para un modelo quirúrgico de la resección del cáncer pancreático en los ratones que mímico el escenario clínico. El modelo puede ser útil para la prueba de tratamientos adyuvantes y neoadyuvantes.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (cáncer pancreático [PC]) se asocia a un pronóstico pobre1. La resección quirúrgica sigue siendo el único tratamiento potencialmente curativo para la PC y se debe considerar para los pacientes que presentan con enfermedad del primero tiempo. Desafortunadamente, incluso con la resección R0 (es decir, márgenes de la resección libres de tumor), la tarifa de la repetición (local o de la enfermedad metastática no detectada) es alta2,3. Por lo tanto, la terapia adyuvante sistémica está indicada en casi todos los pacientes que se someten a la resección4. Además, mientras que la terapia neoadyuvante ahora se recomienda solo para cánceres resecables limítrofes, sus indicaciones se están expandiendo de tal manera que su uso rutinario es el foco de mucha investigación clínica5,6,7,8. Para desarrollar los acercamientos terapéuticos nuevos para la PC que implica la resección, estos acercamientos necesitan primero ser evaluados en los modelos preclínicos que recapitulan exactamente ajustes clínicos.
Los modelos ortotópicos de ratón de PC se han utilizado con frecuencia en el pasado para probar tratamientos farmacológicos9,10. Muchos de éstos fueron producidos por la inyección de células cancerosas solamente en el páncreas del ratón, dando por resultado los tumores que carecían del tejido conectador prominente que es característico de la PC. Más recientemente, los modelos ortotópicos de coinyección, como el que desarrollamos por primera vez inyectando una mezcla de PC humana y células estrelladas pancreáticas humanas (PSC, los principales productores del estroma colagenoso en la PC), han entrado en uso regular11,12. Los tumores producidos por tal co-inyección del cáncer y de las células stromal exhiben (i) los elementos del cáncer y el componente (desmoplastic) stromal característico de la PC, y (ii) proliferación y metástasis de célula cancerosasaumentadas 11. Por lo tanto, este modelo se asemeja mucho a la PC humana. Mientras que un número de modelos reseccionales de la PC orthotopic se han descrito13,14,15,16,ningunos han reflejado las realidades clínicas de la resección pancreática en seres humanos tan exactos como este modelo, y por lo tanto han sido subóptimos para probar tratamientos ayudantes o neoadyuvantes.
Los objetivos del modelo del ratón presentado eran demostrar cómo: (i) implantar con éxito el cáncer pancreático orthotopic mientras que minimizaba la difusión peritoneal inadvertida y (ii) resecar posteriormente totalmente el cáncer. El documento destaca los consejos y posibles escollos de esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un modelo orthotopic resectional del ratón del cáncer pancreático es importante porque permite la prueba de tratamientos ayudantes y neoadjuvant. Esto es particularmente importante en el cáncer de páncreas, donde la cirugía sigue siendo el tratamiento más eficaz, pero se asocia con un alto riesgo de recurrencia. Este papel describe un método que produzca confiablemente un cáncer pancreático que sea potencialmente curable con la resección, replicando el escenario clínico donde se requiere la terapia neoadjuvan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores han recibido apoyo de la Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
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