En ortopisk sambandsmusmodell av bukspottskörtelcancer
Summary
I det kliniska sammanhanget kommer patienter med lokaliserad bukspottskörtelcancer att genomgå bukspottkörtelektomi följt av adjuvant behandling. Detta protokoll rapporteras här syftar till att fastställa en säker och effektiv metod för modellering detta kliniska scenario hos nakna möss, genom ortopic implantation av bukspottskörteln cancer följt av distala bukspottkörtelektomi och splenectomy.
Abstract
Det saknas tillfredsställande djurmodeller för att studera adjuvans och/eller neoadjuvant terapi hos patienter som övervägs för kirurgi av bukspottskörtelcancer (PC). För att ta itu med denna brist beskriver vi en mus modell som omfattar ortopic implantation av PC följt av distala bukspottkörtelektomi och splenectomy. Modellen har visat sig vara säker och lämpligt flexibel för studier av olika terapeutiska metoder i adjuvans och neo adjuvans inställningar.
I denna modell genereras först en bukspottskörteltumör genom att implantera en blandning av mänskliga bukspottskörtelcancerceller (luciferasmärkt AsPC-1) och human cancer associerade bukspottskörtel stellate celler i de distala bukspottkörteln av Balb/c athymic naken möss. Efter tre veckor, cancern resected av re-laparotomy, distala bukspottkörtelektomi och splenectomy. I denna modell kan bioluminescensavbildning användas för att följa utvecklingen av cancer och effekterna av samband/behandlingar. Efter samband kan adjuvansbehandling ges. Alternativt kan neoadjuvant behandling ges före samband.
Representativa data från 45 möss presenteras. Alla möss genomgick framgångsrika distala bukspottkörtelektomi/splenectomy med några problem med hemostas. En makroskopisk proximal bukspottskörtelmarginal större än 5 mm uppnåddes i 43 (96%) möss. Den tekniska framgångsgraden för bukspottskörteln samband var 100%, med 0% tidig dödlighet och sjuklighet. Inget av djuren dog under veckan efter sambandet.
Sammanfattningsvis beskriver vi en robust och reproducerbar teknik för en kirurgisk sambandsmodell av bukspottskörtelcancer hos möss som efterliknar det kliniska scenariot. Modellen kan vara användbar för testning av både adjuvanta och neoadjuvant behandlingar.
Introduction
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (bukspottskörteln cancer [PC]) är associerad med en dålig prognos1. Kirurgiska samband är fortfarande den enda potentiellt botande behandlingen för PC och bör övervägas för patienter som presenterar med tidig sjukdom. Tyvärr, även med R0 samband (dvs. samband marginaler fri från tumör), är återkommande frekvensen (lokal eller från oupptäckt ögonbevarande sjukdom) hög2,3. Därför är systemisk adjuvansbehandling indicerad hos nästan alla patienter som genomgår samband4. Dessutom, medan neoadjuvant terapi nu rekommenderas endast för borderline-resectable cancer, dess indikationer expanderar så att dess rutinmässiga användning är i fokus för mycket klinisk forskning5,6,7,8. För att utveckla nya terapeutiska metoder för PC som involverar samband, dessa metoder måste först bedömas i prekliniska modeller som korrekt rekapitulera kliniska inställningar.
Ortopediska musmodeller av PC har använts ofta tidigare för att testa läkemedelsbehandlingar9,10. Många av dessa producerades genom injektion av cancerceller ensam i mus bukspottkörtel, vilket resulterar i tumörer som saknade den framträdande stroma som är karakteristisk för PC. Mer nyligen har ortopiska modeller med injektion, såsom den vi först utvecklade genom att injicera en blandning av mänskliga PC och mänskliga bukspottskörtel stellatceller (PSC, de primära producenterna av kollagenet stroma i PC), kommit i regelbunden användning11,12. Tumörer som produceras av sådan saminjektion av cancer och stromal celler uppvisar (i) både cancerelementen och den karakteristiska stromal (desmoplastiska) komponenten i PC, och (ii) förbättrad cancer cell spridning och metastasering11. Således liknar denna modell nära mänsklig DATOR. Medan ett antal sambandsmodeller av ortopisk PC harbeskrivits 13 , 14,15,16, ingen har återspeglat de kliniska realiteterna av bukspottskörteln samband hos människor så exakt som denna modell, och därför har varit suboptimal för att testa adjuvant eller neoadjuvant behandlingar.
Syftet med musmodellen som presenterades var att visa hur man: (i) framgångsrikt implantera ortopisk bukspottkörtelcancer samtidigt som oavsiktlig peritoneal spridning minimeras och (ii) därefter helt återförsluta cancern. Papperet belyser tips och potentiella fallgropar av denna teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
En sambandsbar ortopisk musmodell av bukspottskörtelcancer är viktig eftersom det möjliggör testning av adjuvans- och neoadjuvantbehandlingar. Detta är särskilt viktigt vid bukspottskörtelcancer där kirurgi fortfarande är den mest effektiva behandlingen men är förknippad med hög risk för återfall. Detta dokument beskriver en metod som på ett tillförlitligt sätt kommer att producera en bukspottskörtelcancer som kan botas med samband, replikera det kliniska scenariot där neoadjuvant/ adjuvant terapi krä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författare har fått stöd från Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018)
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology – Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019)
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following “curative” resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019)
- Maithel, S. K., Allen, P. J., Jarnagin, W. R. . Blumgart’s Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). , 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
