그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화
Summary
MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.
Abstract
작은 규제 RNA (sRNA)는 삶의 세균 영역 중 널리 퍼져 있지만, 그들 중 많은 기능은 mRNA 목표를 식별하는 어려움으로 인해 특히 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 생체 내특정 sRNA의 모든 RNA 파트너를 드러내는 것을 목표로 RNA 시퀀싱 (MAPS) 기술과 결합된 MS2-선호도 정화의 수정된 프로토콜을 기술했습니다. 광범위하게, MS2 aptamer는 관심의 sRNA의 5’극단에 융합됩니다. 이 구조는 MS2-sRNA가 세포 파트너와 상호 작용할 수 있도록 생체 내에서 발현됩니다. 세균 수확 후, 세포는 기계적으로 lysed. 조추출물은 이전에 말토스 결합 단백질에 융합된 MS2 단백질로 코팅된 아밀로오스 계 크로마토그래피 컬럼에 적재된다. 이를 통해 MS2-sRNA를 특정 캡처하고 RNA를 상호 작용할 수 있습니다. 용출 후, 조정된 RNA는 고처리량 RNA 시퀀싱 및 후속 생물정보 분석으로 확인된다. 다음 프로토콜은 그람 양성 인간 병원체 황색포도상구균에서 구현되었으며, 원칙적으로 모든 그램 양성 박테리아로 변형될 수 있습니다. 요약하자면 MAPS 기술은 특정 sRNA의 규제 네트워크를 깊이 탐구하는 효율적인 방법을 구성하여 전체 대상의 스냅샷을 제공합니다. 그러나 MAPS에서 식별된 대상은 여전히 상호 보완적인 실험 적 접근 방식으로 검증되어야 한다는 점을 명심해야 합니다.
Introduction
수백, 아마도 수천 개의 작은 규제 RNA (sRNA)는 대부분의 세균게놈에서 확인되었지만, 그들 중 대다수의 기능은 특징지어지지 않습니다. 전반적으로, sRNA는 짧은 비코딩 분자, 세균성 생리학및변동하는환경에 적응에 있는 중요한 역할을1,2,3. 실제로, 이 거대 분자는 수많은 복잡한 규제 네트워크의 중심에, 신진 대사 경로에 영향을 미치는, 스트레스 반응뿐만 아니라 독성과 항생 저항. 논리적으로, 그들의 합성은 특정 환경 자극에 의해 트리거됩니다 (예를 들어, 영양소 기아, 산화 또는 막 스트레스). 대부분의 sRNA는 짧고 연속적이지 않은 염기 페어링을 통해 전사 후 수준에서 다중 표적 mRNA를 조절합니다. 그들은 일반적으로 번역 개시 영역4에대한 리보솜과 경쟁하여 번역 개시를 방지합니다. sRNA:mRNA 이중제의 형성은 또한 수시로 특정 RNases의 모집에 의하여 표적 mRNA의 적극적인 저하에 초래됩니다.
sRNA 표적(즉, 표적 RNA의 전체 세트)의 특성화는 개입하는 대사 경로의 식별과 응답할 수 있는 잠재적 신호를 허용합니다. 따라서, 특정 sRNA의 기능은 일반적으로 그것의 targetome에서 유추될 수 있습니다. 이를 위해, 실리코 예측 도구중 몇몇은 IntaRNA 및 CopraRNA5,6,7과같은 개발되었다. 특히 시퀀스 상호 보완성, 잠재적 인 상호 작용 부위의 페어링 에너지 및 접근성에 의존하여 putative sRNA 파트너를 결정합니다. 그러나, 예측 알고리즘은 RNA chaperones8의 참여와 같은 생체 내의 기본 페어링에 영향을 미치는 모든 요인을 통합하지 않으며, 이는 하위 최적 상호 작용 또는 두 파트너의 공동 발현을 선호한다. 고유한 제한으로 인해 예측 도구의 잘못된 긍정 비율은 여전히 높습니다. 대부분의 실험적인 대규모 접근법은 태그된 RNA 결합 단백질(RBP)6,9와상호 작용하는 sRNA:mRNA 커플의 공동 정화에기초한다. 예를 들어, 레깅스 및 시퀀싱(RIL-seq) 방법에 의한 RNA 상호작용은 에체리치아 대장균10,11에서Hfq 및 ProQ와 같은 RNA 샤페론과 공동 정제된 RNA 이중균을 규명하였다. 하이브리드의 UV 크로스링크, 리깅 및 시퀀싱(CLASH)이라는 유사한 기술이 대장균12,13의RNase E-및 Hfq 관련 sRNA에 적용되었다. 여러 박테리아에서 sRNA 매개 조절에서 Hfq 및 ProQ의잘 기술된 역할에도 불구하고8,14,15,sRNA 기반 조절은 S. 아우레우스16,17,18과같은 여러 유기체에서 RNA 샤페론 독립적인 것으로 보인다. RNases와 관련하여 RNA 이중화의 정제가 워터스와 동료(13)에의해 입증 된 것처럼 가능하더라도, 이것은 RNases가 급속한 저하를 유발하기 때문에 까다로운 남아있다. 따라서, RNA 염기서열분석(MAPS)접근법(MAPS)과 결합된 MS2-선호도 정화는19,20은 그러한 유기체에서 견고한 대안을 구성한다.
위에서 언급한 방법과 달리 MAPS는 특정 sRNA를 미끼로 사용하여 상호 작용하는 모든 RNA를 캡처하므로 RBP의 참여에 의존하지 않습니다. 전체 프로세스는 그림 1에표시됩니다. 간단히 말해서, sRNA는 MS2 코트 단백질에 의해 특별히 인식되는 MS2 RNA aptamer와 함께 5’에 태그된다. 이 단백질은 아밀로스 수지에 고정되는 말토스 결합 단백질(MBP)과 융합된다. 따라서, MS2-sRNA 및 그 RNA 파트너는 친화성 크로마토그래피 컬럼상에 유지된다. 말토스를 이용한 용출 후, 공동 정제 된 RNA는 생물학적 정보 분석(도 2)에이어 고처리량 RNA 시퀀싱을 사용하여 식별됩니다. MAPS 기술은 궁극적으로 생체 내에서 발생하는 모든 잠재적 상호 작용에 대한 상호 작용 맵을 그립니다.
MAPS 기술은 원래 비 병원성 그람 음성 박테리아 대장균(21)에서구현되었다. 놀랍게도 MAPS는 RyhB 및 Rybb sRNAs와 특히 상호 작용하는 tRNA 유래 단편을 식별하고 비 유도 조건에서 mRNA 표적을 조절하기 위한 sRNA 전사 소음을 방지하는 데 도움을 주었습니다. 그 후, MAPS는 DsrA22,RprA23,CyaR23 및 GcvB24 (표 1)와같은 다른 대장균 sRNA에 성공적으로 적용되었습니다. MAPS는 이전에 알려진 대상을 확인하는 것 외에도 이러한 잘 알려진 sRNA의 대상을 확장했습니다. 최근, MAPS는 살모넬라 타이피무리움에서 수행되었으며 SraL sRNA가 로mRNA에 결합되어 전사 종료 인자(25)를 코딩한다고 밝혔다. 이 페어링을 통해 SraL은 Rho 자체에 의해 유발되는 조기 전사 종료로부터 rho mRNA를 보호합니다. 흥미롭게도, 이러한 기술은 sRNA에 국한되지 않으며 tRNA 유래단편(26)과 mRNA22(표 1)의번역되지 않은 영역의 사용에 의해 예시된 바와 같이 모든 유형의 세포 RNA에 적용될 수 있다.
MAPS 방법은 또한 병원성 그람 양성 박테리아 S. 아우레우스19에적응되었다. 구체적으로, 용해 프로토콜은 그람 음성 박테리아보다 두꺼운 세포벽으로 세포를 효율적으로 분해하고 RNA 무결성을 유지하기 위해 널리 변형되었다. 이 적응 된 프로토콜은 이미 RsaA27,RsaI28 및 RsaC29의상호 작용을 해명했다. 이 접근은 세포 표면 속성, 포도당 섭취 및 산화 스트레스 반응의 규제 메커니즘에서 이러한 sRNAs의 중요한 역할에 대한 통찰력을 제공했습니다.
2015년 대장균에서 개발 및 구현된 프로토콜은 최근30개세부 사항으로 설명되어 있다. 여기서, 당사는 변형된 MAPS 프로토콜을 제공하며, 이는 비병원성 또는 병원성(안전 예방 조치)이 아닌 그람 양성(두꺼운 세포벽) 박테리아에서 sRNA 규제 네트워크를 연구하는 데 특히 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그람 양성 박테리아에 대한 수정된 프로토콜
MAPS의 초기 프로토콜은 모델 유기체대장균(20)및30에서sRNA 상호작용을 연구하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 기회성 인간 병원체 S. 아우레우스에서 sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화에 적합하고 확실히 그밖 그람 양성 박테리아, 병원성 또는 아닙니다 에 이식할 수 있는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 “기관 내셔널 드 라 레체쉬”(ANR, 그랜트 ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH 및 ANR-18-CE12-0025-04, 코노코, PR)에 의해 지원되었다. 또한 향후 프로그램에 대한 투자의 일환으로 ANR이 관리하는 국가의 자금 지원으로 LabEx NetRNA ANR-10-LABX-0036및 ANR-17-EURE-0023 (PR)의 프레임 워크에 따라 출판되었습니다. DL은 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 계약 제753137-SaRNAReg에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었다. E. Massé Lab의 작업은 캐나다 보건 연구소 (CIHR), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 및 건강 NIH 팀 그랜트 R01 GM01 GM092830-06A1의 국립 연구소로부터 보조금을 운영함으로써 지원되었습니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
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