MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde
Summary
MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo’nun targetom’ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.
Abstract
Yaşamın bakteriyel etki alanı arasında küçük düzenleyici RNA’lar (sRNA’lar) yaygın olsa da, birçoğunun işlevleri özellikle mRNA hedeflerini belirlemenin zorluğu nedeniyle kötü karakterize edilmeye devam etmektedir. Burada, ms2-benzeşim saflaştırma RNA Dizileme (MAPS) teknolojisi ile birleştiğinde, belirli bir sRNA in vivo tüm RNA ortaklarını ortaya çıkarmayı amaçlayan değiştirilmiş bir protokol açıkladık. Genel olarak, MS2 aptamer, ilgi çekici sRNA’nın 5′ ekstremitesine kaynaşmıştır. Bu yapı daha sonra in vivo olarak ifade edilir ve MS2-sRNA’nın hücresel ortaklarıyla etkileşime girmesini sağlar. Bakteri hasadından sonra hücreler mekanik olarak yutmuş. Ham ekstrakt, daha önce maltoz bağlayıcı proteine kaynaşmış MS2 proteini ile kaplanmış amiloz bazlı bir kromatografi sütununa yüklenir. Bu, MS2-sRNA’nın ve etkileşimli RNA’ların özel olarak yakalanmasını sağlar. Efüzyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA’lar yüksek verimli RNA dizilimi ve daha sonra biyoinformatik analiz ile tanımlanır. Aşağıdaki protokol Gram-pozitif insan patojeni Staphylococcus aureus’ta uygulanmıştır ve prensip olarak herhangi bir Gram-pozitif bakteriye transpoze edilebilir. Özetlemek gerekirse, MAPS teknolojisi, belirli bir sRNA’nın düzenleyici ağını derinlemesine keşfetmek için etkili bir yöntem oluşturur ve tüm targetome’unun bir anlık görüntüsünü sunar. Bununla birlikte, MAPS tarafından tanımlanan putatif hedeflerin hala tamamlayıcı deneysel yaklaşımlarla doğrulanmış olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.
Introduction
Çoğu bakteri genomunda yüzlerce, belki de binlerce küçük düzenleyici RNA (sRNA) tanımlanmıştır, ancak bunların büyük çoğunluğunun işlevleri tanımlanmamıştır. Genel olarak, sRNA’lar kısa kodlama dışı moleküllerdir, bakteriyel fizyolojide önemli roller oynarlar ve dalgalanan ortamlara adaptasyon1,2,3. Gerçekten de, bu makromoleküller metabolik yolları, stres yanıtlarını ve aynı zamanda virülans ve antibiyotik direncini etkileyen çok sayıda karmaşık düzenleyici ağın merkezinde yer almaktadır. Mantıksal olarak, sentezleri belirli ortam uyaranları (örneğin, besin açlığı, oksidatif veya membran gerilmeleri) tarafından tetiklenir. Çoğu sRNA, kısa ve bitişik olmayan baz eşleştirme yoluyla transkripsiyon sonrası düzeyde birden fazla hedef mRNA düzenler. Genellikle çeviri başlatma bölgeleri için ribozomlarla rekabet ederek çeviri başlatmayı önlerler4. sRNA:mRNA dublekslerinin oluşumu da genellikle belirli RNa’ların işe alınmasıyla hedef mRNA’nın aktif olarak bozulmasına neden olur.
Bir sRNA targetome’nin karakterizasyonu (yani, hedef RNA’larının tüm kümesi), müdahale ettiği metabolik yolların ve cevap verdiği potansiyel sinyalin tanımlanmasını sağlar. Sonuç olarak, belirli bir sRNA’nın işlevleri genellikle targetomundan çıkarılabilir. Bu amaçla, IntaRNA ve CopraRNA5,6,7gibi siliko tahmin araçlarında birkaç tane geliştirilmiştir. Özellikle putatif sRNA ortaklarını belirlemek için sıra tamamlayıcılığına, eşleştirme enerjisine ve potansiyel etkileşim sitesinin erişilebilirliğine güvenirler. Bununla birlikte, tahmin algoritmaları, RNA refakatçileri8’in alt optimal etkileşimleri veya her iki ortağın birlikte ifadesini tercih etme gibi temel eşleştirmeyi etkileyen tüm faktörleri entegre etmez. Doğal sınırlamaları nedeniyle, tahmin araçlarının yanlış pozitif oranı yüksek kalır. Çoğu deneysel büyük ölçekli yaklaşım, etiketli bir RNA bağlayıcı protein (RBP)6,9ile etkileşime giren sRNA:mRNA çiftlerinin birlikte saflaştırılmasına dayanmaktadır. Örneğin, Ligation ve dizileme ile RNA Etkileşimi (RIL-seq) yöntemi, Escherichia coli10 , 11’dekiHfq ve ProQ gibi RNA refakatçileriyle birlikte saflaştırılmış RNA dublekslerinitanımladı. UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) adı verilen benzer bir teknoloji, E. coli12,13’teki RNase E- ve Hfq ilişkili sRNA’lara uygulandı. Srna aracılı regülasyonda SRNA aracılı düzenlemede Hfq ve ProQ’nun iyi tanımlanmış rollerine rağmen 8,14,15, sRNA tabanlı regülasyon S. aureus16 , 17,18gibi çeşitli organizmalarda RNA refakatçisiz gibi görünmektedir. RNases ile ilişkili RNA dublekslerinin saflaştırılması Waters ve iş arkadaşları13tarafından gösterildiği gibi mümkün olsa bile, RNases hızlı bozulmalarını tetikledikçe bu zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, MS2 Benzeşim Saflaştırması RNA Dizilimi (MAPS) yaklaşımı19,20 ile birleştiğindebutür organizmalarda sağlam bir alternatif oluşturur.
Yukarıda belirtilen yöntemlerin aksine, MAPS tüm etkileşime giren RNA’ları yakalamak için yem olarak belirli bir sRNA kullanır ve bu nedenle bir RBP’nin katılımına dayanmaz. Tüm süreç Şekil 1‘de tasvir edilir. Kısacası, sRNA 5’ ile ms2 kat proteini tarafından özel olarak tanınan MS2 RNA aptamer ile etiketlenmiştir. Bu protein, amiloz reçinesi üzerinde hareketsiz hale getirmek için maltoz bağlayıcı protein (MBP) ile kaynaştırılır. Bu nedenle, MS2-sRNA ve RNA ortakları benzeşim kromatografi sütununda tutulur. Maltoz ile elüsyondan sonra, birlikte saflaştırılmış RNA’lar yüksek verimli RNA dizilimi ve ardından biyoinformatik analiz kullanılarak tanımlanır (Şekil 2). MAPS teknolojisi sonuçta in vivo meydana gelen tüm potansiyel etkileşimlerin etkileşimli bir haritasını çizer.
MAPS teknolojisi başlangıçta patojenik olmayan Gram-negatif bakteri E. coli21’deuygulanmıştır. Dikkat çekici bir şekilde MAPS, hem RyhB hem de RybB sRNA’ları ile özellikle etkileşime giren ve teşvik edici olmayan koşullarda mRNA hedeflerini düzenlemek için herhangi bir sRNA transkripsiyonal gürültüyü önleyen tRNA türevi bir parçanın tanımlanmasına yardımcı oldu. Bundan sonra MAPS, DsrA 22 , RprA 23 , CyaR 23ve GcvB24( Tablo1)gibi diğer E. coli sRNA’larına başarıyla uygulanmıştır. DAHA ÖNCE BILINEN HEDEFLerİ ONAYLADI MAPS, bu iyi bilinen sRNA’ların targetome’larını genişletti. Son zamanlarda, MAPS Salmonella Typhimurium’da gerçekleştirildi ve SraL sRNA’nın rho mRNA’ya bağlandığını, transkripsiyon sonlandırma faktörü25için kodlama yaptığını ortaya koydu. Bu eşleştirme sayesinde SraL, rho mRNA’yı Rho’nun kendisi tarafından tetiklenen erken transkripsiyon sonlandırmasından korur. İlginçtir ki, bu teknoloji sRNA’larla sınırlı değildir ve tRNA türevi bir parça 26 ve mRNA22’nin 5’çevrilmemiş bir bölgesinin kullanılmasıyla örneklenen her türlü hücresel RNA’ya uygulanabilir (Tablo 1).
MAPS yöntemi patojenik Gram-pozitif bakteri S. aureus19’ada uyarlanmıştır. Özellikle, liziz protokolü, Gram negatif bakterilerden daha kalın bir hücre duvarı nedeniyle hücreleri verimli bir şekilde kırmak ve RNA bütünlüğünü korumak için yaygın olarak değiştirilmiştir. Bu uyarlanmış protokol zaten RsaA27, RsaI28 ve RsaC29’un interactom’ınıçözdü. Bu yaklaşım, bu SRNA’ların hücre yüzeyi özelliklerinin düzenleyici mekanizmaları, glikoz alımı ve oksidatif stres yanıtlarındaki önemli rolü hakkında fikir verdi.
2015 yılında E. coli’de geliştirilen ve uygulanan protokol son zamanlarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır30. Burada, patojenik olmayan veya patojenik (güvenlik önlemleri) olsun, Gram-pozitif (daha kalın hücre duvarı) bakterilerdeki sRNA düzenleyici ağları incelemek için özellikle uygun olan değiştirilmiş MAPS protokolünü sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gram-pozitif bakteriler için değiştirilmiş bir protokol
MAPS’in ilk protokolü, E. coli20 , 30model organizmasında sRNA interactom’u incelemek için geliştirilmiştir. Burada, fırsatçı insan patojeni S. aureus’ta sRNA’ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu için uygun olan ve patojenik olsun olmasın diğer Gram-pozitif bakterilere kesinlikle aktarılabilir olan değiştirilmiş bir protokolü açıkl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH ve ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, PR) tarafından desteklendi. Ayrıca labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 ve ANR-17-EURE- 0023 (PR) çerçevesinde, gelecekteki program için yapılan yatırımların bir parçası olarak ANR tarafından yönetilen devletten fon olarak yayınlanmıştır. DL, 753137-SaRNAReg sayılı Marie Skłodowska-Curie Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklendi. E. Massé Lab’deki çalışmalar, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH Ekibi Grant R01 GM092830-06A1’den verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
