Summary
Presentert her er en protokoll for kryogen overføring av frosne prøver til den dynamiske kjernefysiske polarisering (DNP) magiske vinkel spinning (MAS) kjernemagnetisk resonans (NMR) sonde. Protokollen inneholder retninger for rotorlagring før eksperimentet og retninger for levedyktighetsmålinger før og etter eksperimentet.
Abstract
Dynamisk kjernepolarisering (DNP) kan dramatisk øke følsomheten til magisk vinkelspinning (MAS) kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Disse følsomhetsgevinstene øker etter hvert som temperaturen synker og er stor nok til å muliggjøre studiet av molekyler ved svært lave konsentrasjoner ved driftstemperaturene (~ 100 K) til de fleste kommersielle DNP-utstyrte NMR-spektrometre. Dette fører til muligheten for in-cell strukturell biologi på kryopreserverte celler for makromolekyler på deres endogene nivåer i deres hjemlige miljøer. Imidlertid overskrides frysehastighetene som kreves for cellulær kryopreservering under typisk prøvehåndtering for DNP MAS NMR, og dette resulterer i tap av cellulær integritet og levedyktighet. Denne artikkelen beskriver en detaljert protokoll for fremstilling og kryogen overføring av en frossen prøve av pattedyrceller til et MAS NMR-spektrometer.
Introduction
Innføringen av dynamisk kjernefysisk polarisering for magisk vinkelspinnende kjernemagnetisk resonansspektroskopi kan øke følsomheten til MAS NMR med flere størrelsesordener. Dette har gjort det mulig å oppdage biomolekyler ved eller i nærheten av deres fysiologiske konsentrasjoner. DNP kan og gir følsomheten som kreves for å oppdage et isotopisk merket protein ved endogene (~ 1 μM) konsentrasjoner i komplekse biologiske miljø1. Fordi det er veletablerte protokoller for å introdusere isotopisk merkede molekyler i umerkede pattedyrceller uten å påvirke deres levedyktighet, åpner dette muligheten for å studere isotopisk beriket biomolekyler på deres endogene nivåer i deres opprinnelige miljø. Videre, fordi DNP forbedringer er mer effektive ved lavere temperaturer2,3,4, de eksperimentelle temperaturene for DNP MAS NMR justeres pent med de som kreves for langsiktig lagring av levedyktige pattedyrceller5. Den konvensjonelle metoden for å overføre en prøve til et DNP MAS NMR-spektrometer utsetter det imidlertid for temperatursvingninger som brister pattedyrceller.
MAS NMR-eksperimenter krever at prøven roteres om den magiske vinkelen ved frekvenser som er lik eller større enn størrelsen på den anisotrope interaksjonen for at den skal være gjennomsnittlig til null, vanligvis minst 4 kHz og ofte mye høyere6,7,8,9. Prøver er derfor pakket inn i rotorer som har en finnet spiss som brukes til å drive rotasjonen av rotoren med en strøm av gass og har et merke i den andre enden slik at rotasjonsfrekvensen kan overvåkes av et turteller. Prøveoverføring for de fleste MAS NMR-instrumenter oppnås ved å injisere rotoren fra utsiden av instrumentet i statoren på slutten av NMR-sonden med en strøm av tørr luft eller nitrogengass. Etter at rotoren når statoren, som holder rotoren i magisk vinkel, drives prøverotasjon av en luftturbinmekanisme. Separate strømmer av gassstøtte, driver og kontrollerer rotorens temperatur. Å sette inn en rotor i NMR-spektrometeret og oppnå stabil MAS-spinning krever finbearbeidede drivspisser og tett kontroll over temperaturen og trykket til de separate gassstrømmene. Til tross for disse tekniske kravene, er innsetting og oppnå stabil MAS i stor grad automatisert for kommersielle MAS NMR-sonder for bruksområder for romtemperatur.
Situasjonen er imidlertid mer komplisert for bruksområder med lav temperatur. Prøver for bruksområder ved lave temperaturer settes vanligvis inn i spektrometeret ved romtemperatur og fryses i statoren. I det første minuttet reduseres prøvetemperaturen raskt (> −100 °C/min), og systemtemperaturen krever flere minutter å likevekte. På grunn av samspillet mellom temperatur og trykk, blir innsetting og nærmer seg ønsket MAS ofte håndtert manuelt for bruksområder ved lave temperaturer. Til tross for kravet om manuell inngrep, er frysing av rotoren inne i instrumentet gunstig fordi det minimerer innføringen av vann og kondens i sonden, noe som er avgjørende for vellykket spinning. Ikke bare kan kondens og isoppbygging fra omgivelsesfuktighet blokkere gasslinjer, kondens eller frost på rotoren selv kan mekanisk forhindre MAS. Dermed er prøver for lavtemperatur MAS NMR vanligvis frosset inne i instrumentet med hastigheter som overstiger -100 °C/min.
Pattedyrceller kan beholde sin integritet gjennom en fryse-tine syklus hvis kjølingen er langsom5,10,11,12, med en hastighet lik eller langsommere enn 1 °C/min. Alternativt beholder celler også sin integritet hvis kjølehastigheten er ultrarask13,14,15, med en hastighet raskere enn 104 °C/min. Priser mellomliggende til disse to ekstremene brister og dreper pattedyrceller på grunn av iskrystalldannelse både i og utenfor cellene, selv i nærvær av kryobeskyttende midler16. Prøvekjølehastighetene for en romtemperaturrotor inne i en forhåndskjølt sonde faller mellom disse to ytterpunktene, og dermed studere kryogent bevarte intakte levedyktige pattedyrceller, prøver må fryses før overføring til instrumentet og overføres til instrumentet uten temperatursvingninger som kan skade prøven eller opphopningen av frost på rotoren som kan forhindre rotoren i å spinne. Protokollen beskriver en metode for frostfri, forhåndskjølt rotorinnsetting i et kryogent MAS NMR-system for studiet av kryogenisk bevarte intakte pattedyrcelleprøver. Den kryogene prøveoverføringen beskrevet her ble utviklet for NMR-karakterisering av levedyktige intakte celler. Det gjelder imidlertid for alle systemer der temperatursvingninger kan kompromittere prøveintegriteten. Dette inkluderer en rekke komplekse systemer, for eksempel fryseslukkede reaksjoner for kjemisk og strukturell karakterisering av fanget reaksjon mellomprodukter17,18, enzymologi19,20 eller proteinfolding21,22.
Protocol
1. Kultur og kryobeskyttelse av pattedyrceller
- Kultur og høsting av pattedyrceller
- Tine en aliquot av frosne humane embryonale nyreceller (HEK 293).
- Kultur HEK 293 celler i vekstmedier (f.eks. DMEM med 10% foster bovint serum og 1% Pen-Strep) ved 37 °C med 5 % CO2 i 100 mm plater i to til tre passasjer (7-10 dager).
- Del cellene og kulturen i en 150 mm plate til cellene oppnår 90-95% samløp.
MERK: En 150 mm plate ved > 90% samløp vil være tilstrekkelig til å fylle to safirrotorer med en diameter på 3,2 mm. - Høst celler ved hjelp av 4 ml trypsin (se Materialtabell) og 10 ml medier. Overfør suspensjonen til en steril 15 ml konisk og sentrifuge ved 673 x g (1000 rpm) i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten.
- Vask cellepellet med fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2).
- Kryobeskyttelse av celler
- Samle en 50 μL cellepellet i et mikrocentrifugerør. Forbered en blanding av 50 μL PBS og 18 μL glyserol i et eget rør.
- Bland forsiktig 50 μL cellepellet med 68 μL glyserol-PBS-blanding ved å legge glyserol-PBS-blandingen til toppen av pelletsen og resuspender pellet ved å banke forsiktig på siden av røret til ingen klumper gjenstår.
MERK: Skånsom pipettering kan også brukes til å resuspendere cellen, men sørg for at cellulær integritet ikke blir kompromittert.
2. Kryopreservering av pattedyrceller i en NMR-rotor
- Overføring av celler til en 3,2 mm safirrotor.
- For å lage en trakt, kutt en 200 μL pipettespiss og sett den smale enden av den kuttede pipettespissen inn i 3,2 mm rotoren.
- Overfør cellene til trakten som sitter på rotoren. Plasser rotoren sammen med trakten i et mikrocentrifugerør og pellet cellene i bunnen av rotoren ved sentrifugering ved 673 x g i 2-3 min ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og eventuell overflødig prøve fra rotoren. Gjenta disse to trinnene til rotoren er fullpakket med cellene.
MERK: Du kan eventuelt bestemme den cellulære levedyktigheten til prøven før frysing. Resuspend 10 μL av overflødig cellepellet i 100 μL FBS-fri DMEM. Bland 10 μL av suspensjonen med 0,4% trypan blå løsning og vurder umiddelbart levedyktigheten ved hjelp av en automatisert celleteller. Bruk bare FBS-frie medier til å fortynne celler da serum forstyrrer trypanblå farging. - Forsegle rotoren med en silisiumplugg ved hjelp av kommersielt tilgjengelig pakkeverktøy.
- Lukk rotoren med en keramisk drivspiss ved å trykke den vertikalt nedover. Unngå å berøre de delikate finnene på siden av drivspissen.
- Merk halvparten av den nederste kanten av safirrotoren med en sølv permanent markør og den andre halvdelen av rotorens nedre kant med en svart permanent markør for å tillate nøyaktig overvåking av spinningen av rotoren inne i spektrometeret.
MERK: Ufullkommenheter i markeringen av rotoren vil forhindre nøyaktig telling av spinnfrekvensen, noe som resulterer i manglende evne til å oppnå stabil spinning. Fordi markører ikke vil skrive på en frossen rotor og rotoroppvarming kompromitterer prøveintegriteten, er det et kritisk skritt å merke rotoren før frysing.
- Kryopreservering av celler inne i en 3,2 mm safirrotor.
- Legg en pute laget av et stykke vev eller papirhåndkle under lokket og nederst på det kryogene hetteglasset (se Materialbord).
MERK: Vevspapiret beskytter rotormarkeringen mot skader som oppstår ved å støte mot sidene av kryogene hetteglass. - Plasser safirrotoren på 3,2 mm i det kryogene hetteglasset polstret med vevspapiret med den markerte enden vendt mot bunnen av det kryogene hetteglasset.
- Frys rotoren langsomt ved å plassere det kryogene hetteglasset i kjølebeholderen med kontrollert hastighet (-1 °C/min) og plasser beholderen i -80 °C fryser i minst 3 timer.
- Overfør det kryogene hetteglasset som inneholder den frosne rotoren, til lagring av flytende nitrogen.
- Legg en pute laget av et stykke vev eller papirhåndkle under lokket og nederst på det kryogene hetteglasset (se Materialbord).
3. Kryogene overføring av en frossen prøve til NMR-spektrometeret
- Transporter den frosne prøven til NMR-innretningen.
- Overfør det kryogene hetteglasset som inneholder den frosne rotoren til en liten dewar fylt med flytende nitrogen for transport til NMR-anlegget.
- Overføring av frossen rotor til flytende nitrogenbad.
- Fyll en tørr, termisk isolert vidvinkelskum dewar med 500 ml – 1 liter flytende nitrogen.
- Overfør rotoren fra det kryogene hetteglasset til det brede munnskumdewaren fylt med flytende nitrogen.
- Ta det kryogene hetteglasset fra overføringsdewaren i hånden og hold det like over overflaten av det flytende nitrogenet for å beskytte det mot atmosfæren.
- Mens du holder det kryogene hetteglasset med munnen pekende litt nedover, skru av hetten og la rotoren gli inn i det flytende nitrogenbadet.
MERK: Når hetten er skrudd av, må rotoren falle fra det kryogene hetteglasset raskt inn i det flytende nitrogenbadet (under 1 sekund) for å forhindre kondens fra å samle seg på rotoren. Fordampning av flytende nitrogen danner en "nitrogensky" i den brede munnskumdewaren og forhindrer kondens på rotoren før den nedsenkes i det flytende nitrogenet. Lengre eksponering av rotoren til luft kan føre til kondens av fuktighet på rotorvegger som vil kondenseres til is igjen.
- Kryogene overføring av rotor til NMR prøvefanger.
- Prechill et 1,5 ml mikrosenterrør ved å senke det ned i det flytende nitrogenbadet. Ikke lukk røret.
MERK: Inspiser rotoren før du overfører den til mikrosenterrøret. Bruk pinsett, hold rotoren like under overflaten av det flytende nitrogenet og kontroller at rotormarkeringene er intakte, at det ikke har dannet seg isavsetninger på veggene og at drivspissen er intakt. Iskrystallavsetninger på rotorveggene fremstår som hvitt pulver. Pass på at du alltid holder rotoren i kroppen og ikke ved drivspissen. Ikke skrap markeringen av rotoren med pinsettspissene. - Under overflaten av det flytende nitrogenbadet, bruk pinsett for å overføre rotoren til mikrocentrifugerøret med drivspissen vendt mot bunnen av mikrocentrifugerøret og markeringene som vender mot åpningen av røret.
MERK: Tørk alltid pinsett før du senker ned i flytende nitrogen eller berører rotoren. - Bruk pinsett, hold røret som inneholder rotoren under flytende nitrogen ved halsen.
- Med et annet par pinsett i hånden, vær forberedt på å nedsenke NMR-prøvefangeren i det flytende nitrogenbadet og hold det slik at det er tilbøyelig i en akutt vinkel med hensyn til mikrocentrifugerøret.
MERK: Minimer tiden prøvefangeren kommer i kontakt med det flytende nitrogenet for å unngå frysing av O-ringen. Hvis O-ringen fryser, vil det være svært vanskelig å sette fangeren inn i spektrometeret.
- Prechill et 1,5 ml mikrosenterrør ved å senke det ned i det flytende nitrogenbadet. Ikke lukk røret.
- Kryogene rotoroverføringer fra NMR-prøvefangeren til NMR-spektrometeret
MERK: Dette trinnet krever to personer, en for å betjene kryolabnet og en for å overføre prøven fra det flytende nitrogenet til sonden.- Plasser kryolabnet i utkastermodus ved å trykke på 'EJECT' på skapet.
MERK: Utkastelsesmodusen renser den tørre og kalde nitrogengassstrømmen ved høyt trykk fra sonden til atmosfæren for å forhindre inngangen til atmosfærisk fuktighet. - Overfør rotoren til NMR-prøvefangeren.
- Sett den åpne enden av NMR-prøvefangeren inn i mikrosenterrøret mens den fortsatt er under overflaten av det flytende nitrogenet.
- Løft opp både mikrosenterrøret og NMR-prøvefangeren slik at rotoren kan falle inn i prøvefangeren. Rist NMR-prøvefangeren og mikrocentrifugerøret i tilfelle rotoren sitter fast på kanten av prøvefangeren.
- La det tomme mikrosenterrøret være på toppen av NMR-prøvefangeren for å beskytte rotoren mot luft.
- Fjern den andre tomme NMR-prøvefangeren fra sonden og legg den på gulvet.
- Overfør NMR-prøvefangeren som inneholder rotoren, fjern mikrosenterrøret og sett det umiddelbart inn i sonden.
MERK: Hvis O-ringen fryser, vil det være vanskelig å stramme prøvefangeren. Fortsett å bruke kraft til den glir på plass. - Signaliser personen som bruker kryolabnet til STOP EJECT og INSERT.
MERK: Innsettingsmodusen leder rotoren fra prøvefangeren inn i sonden. - Spinn opp prøven til ønsket spinnhastighet (f.eks. 12 kHz) ved å justere lageret og kjørestrømtrykket som styres av kryolabnet. (f.eks. Øk lagergassen umiddelbart til ~200 mBar og drivgassen til 10 mBar. Når prøven spinner, øk lagergassen til 1000 mBar og kjør gass til 200 mBar. Når spinningen stabiliserer seg, øker du lageret til 2400 mBar og øker deretter drivgassen fra 200 mBar til 1700 mBar over flere minutter. VT-kjølegass er konstant ved ~ 1070 l / t.)
MERK: Når du løfter mikrosentrifugerøret og NMR-prøvefangeren ut av det flytende nitrogenbadet, må du sørge for at mikrocentrifugerøret har nok flytende nitrogen inni seg til å omgi rotoren. Minimer tiden mellom å overføre rotoren til NMR-prøvefangeren og sette NMR-prøvefangeren inn i spektrometeret. Alle trinnene i 3.4 skal fullføres innen 30 s.
- Plasser kryolabnet i utkastermodus ved å trykke på 'EJECT' på skapet.
4. Kryogene fjerning av prøven fra NMR-spektrometeret
- Tilberedning av flytende nitrogenbad og det kryogeniske hetteglasset
- Hell 500 ml - 1 L flytende nitrogen i den brede munnskumdewaren og legg badekaret under spektrometeret.
- Forkjøl det kryogeniske hetteglasset. Senk det tomme kryogeniske hetteglasset som inneholder et stykke vevpapir i det flytende nitrogenbadet.
- Kryogene overføring av rotor fra sonde til kryogent hetteglass
- Reduser spinnhastigheten til 0 kHz ved å øke kjøre- og lagergassstrømmen og kaste ut rotoren ved å bytte til utkastermodus.
- Hold utkastermodus på, fjern prøvefangeren fra sonden, slipp rotoren direkte inn i den brede munnskumdewaren som inneholder flytende nitrogen.
- Bruk forhåndskjølte pinsett, overfør rotoren til forkjølt kryogent hetteglass under overflaten av det flytende nitrogenet.
- Cap det kryogene hetteglasset. Prechill den kryogene hetteglasshetten ved å dyppe den i flytende nitrogen. Fjern det kryogene hetteglasset som inneholder rotoren og flytende nitrogen fra badekaret og hette røret med forhåndsklokket hette. Ikke stram hetten slik at fordamping av nitrogen trygt kan frigjøres.
- Senk det kryogeniske hetteglasset i flytende nitrogen på nytt. Prøven kan overføres til langtids lagring av flytende nitrogen eller pakkes ut umiddelbart for videre analyse.
5. Utpakking av rotor- og levedyktighetsmålinger
- Utpakking av rotor og måle levedyktighet
- Forvarm serumfrie medier (DMEM) eller PBS til 37 °C.
- Fjern rotoren fra flytende nitrogen. Fjern stasjonsspiss og silisiumplugg.
MERK: Safir er en utmerket varmeleder. Unngå å berøre rotoren med fingrene fordi varmeoverføring kan føre til lokale fryse-tine hendelser som kompromitterer cellulær levedyktighet.
- Måling av levedyktighet
- Tilsett 20 μL varme medier til den frosne cellepelleten i rotoren og resuspendcellene. Fjern suspensjonen med en pipette og bland suspensjonen med 100 μL medier.
- Fjern 10 μL cellefjæring og bland med likt volum på 0,4% trypan blå løsning (v / v). Inkuber ved romtemperatur i 30 s til 1 min.
- Mål levedyktigheten ved hjelp av automatisert celleteller.
Representative Results
Kryogene innsetting av prefroste prøver av pattedyrceller i NMR-spektrometeret støtter levedyktighet gjennom NMR-eksperimentet. Skjemaer for kryogen overføring av en frossen prøve til en forhåndskjølt NMR-sonde er vist i figur 1. Cellulær levedyktighet og intakthet kan vurderes ved hjelp av en rekke metoder. Her brukte vi et standard fargestoffbasert mål på membranintegritet, som stemmer godt overens med andre metoder23. Intakte celler er ugjennomtrengelige for å prøve blått, mens celler med kompromittert membranintegritet er gjennomtrengelige. Antall trypan blå gjennomtrengelige og ugjennomtrengelige celler kan raskt vurderes ved hjelp av en automatisert celleteller. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, er trypan blå permeabilitet av pattedyrceller etter MAS NMR (dvs. ved punkt 5.2.3) lik trypan blå permeabilitet av pattedyrceller før noen temperaturendring (dvs. punkt 2.1.3). Men hvis cellene er langsomt frosset, deretter oppvarmet til romtemperatur før innsetting (dvs. etter protokollen til punkt 3 før du varmer rotoren til romtemperatur før de settes inn i den avkjølte sonden), reduseres cellulær levedyktighet som vurdert av trypan blue til mindre enn 10% av cellene (Figur 2). Dermed resulterer fryseceller inne i spektrometeret i tap av cellulær membranintegritet mens kryogene innsetting av frosne prøver av pattedyrceller støtter celle levedyktighet gjennom NMR-eksperimentet.
Figur 1: Skjematisk for kryogen overføring av en frossen prøve til en forhåndskjølt NMR-sonde. (A) Nærmet deg overflaten av det flytende nitrogenet og skru av toppen av det kryogene hetteglasset. (B) Skyv rotoren inn i det flytende nitrogenbadet. (C) Senk et mikrosenterrør ned med pinsett og hold det på plass til det avkjøles helt. (D) Sett rotoren inn i mikrosentrifugen med drivspissen vendt mot bunnen av røret. Dytt, i stedet for å gripe, med pinsettene. (E) Hold mikrosentrifugerøret like under overflaten av det flytende nitrogenbadet og kontroller rotoren visuelt for å sikre at den er frostfri og godt merket. (F) Hold prøvefangeren i en vinkel over overflaten. (G) Løft prøvefangeren og røret ut av det flytende nitrogenet så snart prøvefangeren er inne i mikrosenterrøret. (H) Rist prøvefangeren hvis rotoren sitter fast på kanten. (I) Fjern den tomme prøvefangeren fra sonden og legg den på bakken. (J) Fjern mikrosenterrøret fra prøvefangeren med rotoren inni, sett inn, stram prøvefangeren i proben og trykk "INSERT" på kontrollkonsollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kryogene innsettinger av en forhåndsfryst utvalg av pattedyrceller resulterer i målinger av cellulær intakthet som ligner på pattedyrceller som aldri har vært frosset. Prosentandelen av trypan blå ugjennomtrengelige celler for prøver som aldri har vært frosset (f.eks. trinn 2.1.3) ligner på celler for prøver etter MAS NMR (f.eks. trinn 5.2.3 med 12 kHz MAS). Langsomme frosne celler (f.eks. trinn 3) som ble varmet opp til romtemperatur før innsetting i NMR-instrumentet som var forhåndskjølt til 100 K, hadde mye lavere prosentandeler av intakte celler etter MAS NMR med 12 kHz MAS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Den kryogene overføringen av frosne prøver til et NMR-spektrometer lykkes i å bevare levedyktigheten til frosne pattedyrceller gjennom NMR-datainnsamlingen. Suksessen til denne metoden er demonstrert i pre og post MAS NMR levedyktighetsmålinger. Denne tilnærmingen er vellykket og generaliserbar for ethvert system der temperatursvingninger kan kompromittere prøveintegriteten. Den presenterte protokollen utføres med HEK 293-cellelinjen. Fordi kryopreserveringsforholdene for mange pattedyrcellelinjer er svært like, er det sannsynlig at forholdene som rapporteres her, kan oversettes til andre cellulære systemer; De kan imidlertid kreve ytterligere optimalisering av kryoprektanter, prøvevolumer og frysehastigheter for å oppnå de samme resultatene.
Denne metodikken kan forbedres ved å pakke ut rotoren raskere etter NMR-eksperimentet. Dette trinnet er for tiden sub optimalt, og utførelsen påvirker levedyktigheten til cellene. Før cellene kan brukes på nytt i media, må drivspissen og silisiumpluggen fjernes fra rotoren. Prøven tiner ujevnt når rotoren holdes under fjerning av drivspissen og silisiumpluggen, slik at kortere rotorhåndteringstider resulterer i høyere viaevner. Utviklingen av rotorholdere eller andre verktøy for å lette jevn opptining og rask fjerning av drivspissen og silisiumpluggen vil bidra til å gjøre etter-NMR-vurderingen av levedyktighet mer nøyaktig.
Tilnærmingen til kryogene prøvelastinger beskrevet i denne artikkelen er begrenset til NMR-sonder som støtter prøveinnsetting og utkastelse med sonden på plass i boringen av NMR-magneten. Selv om innsetting og utløsing av eksterne prøver er standard for kommersielle DNP-systemer, har egendefinerte sonder ikke alltid dette alternativet. Denne tilnærmingen til kryogene prøvelastinger kan også kreve en viss modifikasjon for NMR-sonder bygget for å være kompatible med rotorer i forskjellige størrelser. Denne protokollen er optimalisert for 3,2 mm rotorer og kan kreve modifikasjon hvis prøvefangerens ytre diameter overstiger den indre diameteren til et mikrosenterrør (f.eks. trinn 3.4.2).
Med anvendelsen av DNP til MAS NMR er det nå mulig å oppdage proteiner og andre biomolekyler ved endogene fysiologiske konsentrasjoner24,25,26. Dette åpner muligheten for å studere biomolekyler i sine hjemlige miljøer. Vedlikehold av cellulær integritet og levedyktighet gjennom hele eksperimentet vil sannsynligvis være avgjørende for å koble de eksperimentelle resultatene av spektroskopien til biologiske fenomener. Ukontrollert frysing av prøver som inneholder rensede proteiner eller cellulære lysater, kompromitterer vanligvis ikke prøvekvalitet7,27, selv om det er noen indikasjoner på at frysehastigheten kan være en viktig variabel selv i rensede systemer28. Imidlertid må prøver av pattedyrceller fryses i kontrollert hastighet hvis bevaring av cellulær intakthet og levedyktighet er viktig for tolkningen. Her presenterer vi en protokoll for frysing og overføring av frosne prøver av pattedyrceller til et forhåndskjølt DNP MAS NMR-instrument som unngår potensielt skadelige temperatursvingninger og støtter måling på levedyktige celler.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Cancer Research Prevention &Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; National Institutes of Health [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation og Kinship Foundation (Searle Scholars Program) til K.K.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
| 100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
| 3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
| 45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
| Black and Silver marker | Sharpie | ||
| Cap removal tool | Bruker | HZ16913 | |
| Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
| Ceramic cap | Cortecnet | HZ12372 | |
| CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
| d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
| Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| DNP NMR system with frequency-matched gyrotron | Bruker | ||
| Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
| Kimwipes | Kimwipes | ||
| Packing tool | Bruker | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
| Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Silicon plug | Bruker | B7089 | |
| Standard Vessel forceps | |||
| Tryp-L | Gibco | 12605010 |
References
- Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
- Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
- Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
- Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
- Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
- Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
- Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
- Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
- Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
- Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
- Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
- Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
- Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
- Pegg, D. E.
- Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
- Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
- Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
- Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
- Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
- Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
- Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D.
- Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
- Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
- Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
- Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
- Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).
