절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석
Summary
절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.
Abstract
실험실에서 배양한 조직이나 의료 기기를 개인에게 이식하는 성공 여부는 이식 숙주의 면역 반응에 달려 있습니다. 임플란트를 이물질로 간주하면 적대적이고 조절되지 않는 면역 반응은 임플란트의 거부 반응을 초래할 수 있는 반면, 조절된 반응과 항상성의 회복은 임플란트의 수용으로 이어질 수 있습니다. in vivo 또는 ex vivo 환경에서 해부된 임플란트의 미세환경을 분석하면 면역 반응 패턴을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 궁극적으로 차세대 생체 재료 개발에 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 세포 표면 마커를 기반으로 면역 세포와 그 하위 집합을 특성화하는 데 잘 알려진 기법입니다. 본 연구에서는 절개된 임플란트 조직에서 균일한 세포 현탁액을 분리하기 위해 세포 스트레이너를 통한 수동 다이싱, 효소 분해 및 여과를 기반으로 하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 유세포 분석을 통해 이러한 분리된 세포를 특성화하고 정량화하기 위한 초기 유세포 분석기 설정 단계와 함께 multicolor 유세포 분석 염색 프로토콜이 설명되었습니다.
Introduction
의학 분야의 발전으로 인해 손상된 조직의 기능 또는 재성장을 지원하기 위해 이식된 재료가 자주 사용되었다 1,2. 여기에는 심박 조율기, 재건 미용 임플란트 및 골절 고정에 사용되는 정형외과 플레이트와 같은 장치가 포함됩니다 3,4. 그러나 이러한 임플란트를 만드는 데 사용되는 재료와 임플란트가 이식되는 위치는 이러한 임플란트의 성공을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다 5,6,7. 이러한 임플란트는 이물질로서 숙주로부터 면역 반응을 일으켜 거부 반응 또는 내성을 유발할 수 있다8. 이 요인은 착상 후 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 생성하기 위한 생체 재료 연구를 주도했습니다 9,10,11,12.
면역 반응은 손상된 조직 또는 장기를 교체하기 위해 실험실에서 생체 재료 골격(스캐폴드) 주위에 조직 또는 장기를 성장시키는 재생 의학 분야에서 필수적인 요구 사항입니다13,14,15,16. 재생 의학의 목표는 세포, 신호 및 지지체를 사용하여 누락되거나 손상된 조직을 대체하는 것이며, 각각은 면역 반응에 의해 크게 조절될 수 있습니다17. 더욱이, 면역 반응의 결핍이 원하는 경우에도, 면역 활성의 결핍은 매우 드물게 바람직한 조절 프로파일의 존재가 아니라 면역 활성의 부재이다18. 유세포 분석과 같은 기술은 임플란트 장치를 코팅하거나 조직 공학을 위한 스캐폴드를 개발하는 데 사용되는 다양한 생체 재료에 대한 면역 반응 패턴을 특성화하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다19.
이 정보는 궁극적으로 면역 체계가 잘 견딜 수 있는 임플란트용 생체 재료를 개발하거나 조직 공학에서 건설적인 역할을 할 수 있는 지지체를 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 유세포 분석에 의한 분석을 위한 시료의 적절한 준비는 형광 활성화 세포 분류를 통한 면역 특성 분석에서 부정확한 결과를 피하기 위한 중요한 단계입니다20,21. 따라서 본 연구는 스캐폴드 조직에서 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하는 데 활용할 수 있는 상세한 방법론을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 균일한 세포 현탁액을 얻기 위해 생체재료 임플란트에서 세포를 분리하는 상세한 방법론을 기술한다. 또한 multicolor 유세포 분석을 위한 세포 현탁액을 염색하기 위한 자세한 프로토콜과 최적의 결과를 위해 유세포 분석기를 구성하는 단계가 제공되었습니다. 세포 분리 방법은 여러 단계를 포함할 수 있으며, 종종 수동 조직 절개 후 단백질 분해 효소를 사용한 효소 분해를 사용하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 생물 의학 이미징 및 생물 공학 연구소 (National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)를 포함한 NIH의 교내 연구 프로그램 (Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 면책 조항: NIH, 그 임원 및 직원은 회사, 제품 또는 서비스를 추천하거나 보증하지 않습니다.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
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