Систематический подход к выявлению новых противомикробных и антибиопленных молекул из экстрактов растений и фракций для предотвращения кариеса зубов

Summary

Натуральные продукты представляют собой перспективные отправные точки для разработки новых лекарственных средств и терапевтических средств. Однако, из-за высокого химического разнообразия, поиск новых терапевтических соединений из растений является сложной и трудоемкой задачей. Мы описываем упрощенный подход к выявлению молекул противомикробных препаратов и антибиоплений из растительных экстрактов и фракций.

Abstract

Натуральные продукты обеспечивают структурно различные вещества, с множеством биологических видов деятельности. Однако выявление и изоляция активных соединений от растений являются сложными из-за сложной матрицы растений и трудоемких процедур изоляции и идентификации. Поэтому представлен пошаговая подход к скринингу природных соединений растений, включая изоляцию и идентификацию потенциально активных молекул. Она включает в себя сбор растительного материала; подготовка и фракция сырых экстрактов; подходы к хроматографии и спектрометрии (UHPLC-DAD-HRMS и NMR) для анализа и идентификации соединений; биоанализ (антимикробная и антибиопленная деятельность; бактериальная “сила адгезии” к слюнной пелликуле и начальной глюканой матрице, обработанной отдельными методами лечения); и анализ данных. Модель проста, воспроизводима и позволяет последовательно контролировать скрининг нескольких соединений, концентраций и этапов лечения. Полученные данные обеспечивают основу для будущих исследований, включая формулировки с наиболее активными экстрактами и/или фракциями, изоляцию молекул, моделирование молекул до конкретных целей в микробных клетках и биопленки. Например, одной из мишеней для контроля кариогенной биопленки является ингибирование активности глюканов стрептококка мутан, которые синтезируют глюканы внеклеточной матрицы. Ингибирование этих ферментов предотвращает накопление биопленки, уменьшая ее вирулентность.

Introduction

Самые ранние модели медицины, используемые в обществах, основывались на натуральных продуктах (НП). С тех пор люди искали новые химические вещества в природе, которые могут быть преобразованы в наркотики¹. Этот поиск вызвал постоянное совершенствование технологий и методов этноботалогического^{скрининга 1,2,3.} NPs предлагают богатый источник структурно разнообразных веществ, с широким спектром биологической деятельности, полезной для разработки альтернативных или адъювантных методов лечения. Тем не менее, присущая комплексная матрица растений делает изоляцию и идентификацию активных соединений сложной и трудоемкой задачей^4.

NPs-основанные снадобья или формулировки можно использовать для того чтобы предотвратить and/or обработать несколько условий влияя на устные, включая зубового^{кариеса 4.} Кариес зубов, один из самых распространенных хронических заболеваний во всем мире, вытекает из взаимодействия богатых сахаром диеты и микробных биопленок (зубной налет), образуется на поверхности зуба, что приводит к деминерализации, вызванной органическими кислотами, полученными из микробного метаболизма, и если не лечить,^{приводит к потере зубов 5,6}. Хотя другие микроорганизмы могут быть^{связаны 7}, Streptococcus mutans является одним из важнейших кариогенных бактерий, потому что это кислогенный, кислый, и внеклеточной матрицы строитель. Этот вид кодирует несколько экзоэнзимов (например, гликозилтрансферазы или Гтфы), которые используют сахарозу в^{качестве субстрата 8 для построения внеклеточной} матрицы, богатой экзополисахаридами, которые являются детерминантом^{вирулентности 9}. Кроме того, грибОк Candida Albicans может привести к производству, что внеклеточной матрицы⁷. Хотя фтор, вводят в различных условиях, остается основой для предотвращения^{кариеса зубов 10}, новые подходы необходимы в качестве адъювантов для повышения его эффективности. Кроме того, имеющиеся методы борьбы с бляшками основаны на использовании микробицидных агентов широкого спектра действия (например, хлоргексидина)¹¹. В качестве альтернативы, NPs являются потенциальными методами лечения для контроля биопленок и предотвращения^{кариеса зубов 12,13}.

Дальнейший прогресс в открытии новых биологически активных соединений растений включает в себя необходимые шаги или подходы, такие, как: i) использование надежных и воспроизводимых протоколов отбора проб, учитывая, что растения часто проявляют внутриспецифическую изменчивость; ii) подготовка всеобъемлющих экстрактов и их соответствующих фракций в небольших масштабах; iii) характеристика и/или dereplication их химических профилей думали приобретение многомерных данных, таких как GC-MS, LC-DAD-MS, или NMR, например; iv) использование жизнеспособных и высокодоходных моделей для оценки биоактивности; v) выбор потенциальных новых попаданий на основе многовариантного анализа данных или других статистических инструментов; vi) для выполнения изоляции и очистки целевых соединений или перспективных кандидатов; и (vii) проверка соответствующих биологических действий с использованием изолированных^{соединений 2,14}.

Dereplication является процесс быстрого выявления известных соединений в сырой экстракт и позволяет дифференциации новых соединений из тех, которые уже были изучены. Кроме того, этот процесс предотвращает изоляцию, когда биоактивность уже описана для некоторых соединений, и это особенно полезно для обнаружения “часто нападающих”. Он использовался в различных нецелесооборотных рабочих процессах, начиная от идентификации основных соединений или ускорения фракционования, управляемого деятельностью, до химического профилирования коллекций экстрактов. Он может быть полностью интегрирован с метаболомическими исследованиями для нецелесофильного химического профилирования CE или целевой идентификации метаболитов. Все это в конечном итоге приводит к приоритизации экстрактов перед^{процедурами изоляции 1,15,16,17.}

Поэтому в настоящей рукописи мы описываем систематический подход к выявлению молекул противомикробных и антибиопленных из растительных экстрактов и фракций. Она включает в себя четыре междисциплинарных этапа: (1) сбор растительного материала; (2) подготовка сырых экстрактов (CE) и фракций (CEF), а затем их химический анализ профиля; (3) биоанализ; и (4) анализ биологических и химических данных(рисунок 1). Таким образом, мы представляем протокол, разработанный для анализа противомикробной и антибиопленной деятельности экстрактов и фракций Casearia sylvestris против стрептококковых мутанов и candida albicans^13,а также процедуры фитохимической характеристики и анализа данных. Для простоты, основное внимание здесь, чтобы продемонстрировать подход к скринингу природных соединений с использованием бактерии.

Рисунок 1: Поток-график системного подхода к выявлению активных молекул из растительных экстрактов и фракций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Protocol

1. Коллекция растительного материала Растительный материал Запись доступа к растительному материалу на электронных платформах, которые регулируют доступ к генетическому наследию в стране, где будет проходить сбор. Например, в Бразилии зарегистрируйтесь в Национальной систе…

Representative Results

Мы предоставляем пример использования систематического подхода для проверки биологической активности растительных экстрактов и фракций для выявления потенциально активных молекул для возможных новых анти-кари терапии: противомикробные и антибиопленные деятельности Экстракты Cas…

Discussion

Основными проблемами, связанными с работой с натуральными экстрактами сырой нефти, являются их сложный состав и недостатки классических исследований биоуместной изоляции. Хотя этот процесс идет медленно, он эффективен и привел к крупным выводам в исследованиях NP. Для рационализации н…

Materials

96-well microplates	Kasvi	Flat bottom
Activated carbon	LABSYNTH	Clean up and/or fractionation step
Analytical mill	Ika LabortechniK	Model A11 Basic
Blood agar plates	Laborclin
Chromatographic column C18	Phenomenex Kinetex	150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
ELISA plate reader	Biochrom Ez
Ethanol	J. T. Baker	For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
Ethyl acetate	J. T. Baker	Fractionation step
GraphPad Software	La Jolla	GraphPad Prism7
Hexane	J. T. Baker	Fractionation step
Incubator	Thermo Scientific
Isopropanol	J. T. Baker	For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer)	Savant	Modulyo
Nylon Millipore	LAC	0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker	Quimis	Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Silica gel	Merck	40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl)	Synth	0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE)	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Tryptone	Difco
UHPLC-DAD	Dionex	Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath	UNIQUE	Model USC 2800
Yeast extract	Difco