Точное перечисление фолликула в яичниках взрослых мышей

Summary

Здесь мы описываем, сравниваем и противопоставляем два различных метода точного подсчета фолликулов фиксированных тканей яичников мыши.

Abstract

Сексуально размножающиеся самки млекопитающих рождаются с их пожизненным запасом яйцеклеток. Незрелые, тихие яйцеклетки находятся в изначальных фолликулах, единице хранения женской зародышевой линии. Они не являются возобновляемыми, поэтому их число при рождении и последующие темпы потерь в значительной степени диктует женскую плодородную продолжительность жизни. Точная количественная оценка количества изначальных фолликулов у женщин и животных имеет важное значение для определения воздействия лекарственных средств и токсикантов на резерв яичников. Необходимо также оценить необходимость и успех существующих и новых методов сохранения фертильности. В настоящее время не существует методов точного измерения количества изначальных фолликулов, включающих резерв яичников у женщин. Кроме того, получение ткани яичников от крупных животных или исчезающих видов для экспериментов часто не представляется возможным. Таким образом, мыши стали важной моделью для таких исследований, и способность оценивать изначальные числа фолликулов в целых яичниках мыши является критическим инструментом. Тем не менее, сообщения об абсолютных числах фолликулов в яичниках мыши в литературе весьма изменчивы, что затрудняет сравнение и/или репликацию данных. Это связано с рядом факторов, включая напряжение, возраст, группы лечения, а также технические различия в методах подсчета занятых. В этой статье мы предоставляем пошаговое учебное руководство по подготовке гистологических разделов и подсчету изначальных фолликулов в яичниках мыши с использованием двух различных методов: стереологии, которая опирается на метод фракционной/оптической препаратора; и метод прямого подсчета. Некоторые из ключевых преимуществ и недостатков каждого метода будут выделены таким образом, чтобы можно было улучшить воспроизводимость в полевых условиях и дать исследователям возможность выбрать наиболее подходящий метод для своих исследований.

Introduction

Незрелые, меиотически арестованных яйцеклеток, хранящихся в изначальных фолликулов в яичнике являются единицей хранения для женской зародышевой линии и составляют пожизненный резерв яичников человека. Изначальные номера фолликулов снижаются естественным образом^{с возрастом 1}, или же, может быть преждевременно истощены после воздействия экзогенных химических веществ, в том числе некоторые фармацевтические препараты и экологические токсиканты в воздухе, пище и воде². Учитывая, что изначальное число фолликулов является конечным, количество и качество фолликулов, присутствующих в яичнике в значительной степени определить женскую плодовитости и здоровья потомства. Таким образом, точная количестве изначальных фолликулов у женщин имеет важное значение для оценки внецелевых воздействий экзогенных оскорблений на резерв яичников.

У женщин анализ всего яичника, как правило, не возможно, поэтому неинвазивные суррогатные меры резерва яичников должны быть использованы в клинических условиях. Анти-Mϋllerian гормона (AMH) является наиболее широко используемым суррогатным биомаркером клинически³. Уровни АМГ сыворотки часто измеряются у женщин преклонного материнского возраста или до и после лечения рака, например, химиотерапии. Тем не менее, AMH производится растущими фолликулами, а не изначальными фолликулами, и, таким образом, уровни сыворотки не сообщают об абсолютном количестве изначальных фолликулов.

При отсутствии методов точного определения количества изначальных фолликулов у женщин на месте, подсчет фолликуловяичников в мелких животных моделях, таких как грызуны, остается важным инструментом исследования для оценки степени, с помощью которой экзогенные оскорбления влияют на изначальные фолликулы и, следовательно, плодовитости. К сожалению, хотя, доклады по всей литературе изначальных фолликулов номера в моделях грызунов являются весьма^{переменной 4}. Одной из основных причин этого являются широко используемые технические различия в методе подсчета голосов. Преимущественно, Есть два различных методов, описанных в литературе для перечисления изначальных фолликулов у мышей. К ним относятся стереология, которая использует метод оптического препаратора фракциотора, и прямые отсчеты фолликулов.

Стереология широко рассматривается золотой стандарт, как он использует систематические равномерной^{случайной выборки 5}, что делает его наиболее точным методом количественной изначальной числа фолликула в целом мыши, или крысы^{яичников 4,6,7}. Стереология непредвзята, так как она объясняет трехмерную структуру объекта интереса⁸. Используя метод оптического рассечения/фракционного метода, три уровня выборки применяются для количественной оценки изначальных фолликулов с использованием толстых секций тканей (например, 20 мкм) в пределах известной доли от общего яичника мыши. Во-первых, выбран интервал отбора проб (например, каждый 3-й раздел) при случайном запуске (выборка фракции 1, f₁)^4. Разделы затем пробы в систематической, равномерной манере с этого момента через весь яичник. Затем, непредвзятый подсчет кадра накладывается на секцию яичников и постепенно перемещается по определенной, рандомизированной сетке подсчета (выборка фракция 2, f₂)⁸. Наконец, известная доля толщины секции оптически пробы (например, 10 мкм) и фолликулы в этой области учитываются (выборка фракции 3, f₃)⁴. Количество необработанных фолликулов умножается на обратные эти фракции выборки для получения конечного значения. Этот метод требует экспертной подготовки и оборудования, в том числе микроскопа с моторизованной стадией, управляемой стереологическим программным обеспечением. Ткани должны быть сохранены в специализированной фиксатор Буин, и встроенные в гликольметакрилат смолы, чтобы для толстых секций ткани, которые будут сокращены с помощью микротома гликольметакрилат смолы со стеклянным ножом. Этот метод предназначен для учета усадки тканей и деформации, чтобы наилучшим образом сохранить трехмерную морфологическую структуру яичников и^{фолликулов 9.}

Прямой подсчет фолликулов является наиболее часто используемым методом подсчета фолликулов¹⁰. Можно использовать более распространенные фиксаторы (т.е. формалин), за которыми следует встраивание парафинового воска и исчерпывающее последовательное сечение с использованием стандартного микротома толщиной от 4 до 6 мкм. Фолликулы систематически подсчитываются во всей секции тканей через определенный интервал, а затем умножаются на обратный интервал выборки для получения общей оценки фолликула. Этот метод быстрый, простой, может быть выполнен с использованием архивных тканей, и подготовлен с использованием стандартных гистологических методов. Для этого требуется только световой микроскоп со стандартными возможностями визуализации. Однако, несмотря на эти преимущества, прямой подсчет фолликулов не хватает точности и строгих параметров подсчета стереологии, что делает его более склонным к следователю предвзятости. Кроме того, ткани могут подвергаться усадки и деформации во время обработки, нарушая целостность и морфологию яичников и тем самым делая классификацию фолликулов и количественной оценки трудно.

Цель этой статьи состоит в том, чтобы описать два широко используемых метода количественной оценки числа изначальных фолликулов в яичниках мыши: стереология и прямой подсчет фолликулов. Мы предоставим подробные протоколы для этих двух методов и подчеркем некоторые из их сильных и слабых сторон, с тем чтобы повысить воспроизводимость в нашей области и позволить исследователям принять обоснованное решение о наиболее подходящем методе подсчета для своих исследований.

Protocol

Яичники были собраны у самок мышей C57BL6J. Все процедуры и эксперименты на животных были проведены в соответствии с Австралийским кодексом практики NHMRC по уходу и использованию животных и одобрены Комитетом по этике животных исследовательской платформы Monash Animal. ПРИМЕЧАНИ?…

Representative Results

Была использована хорошо охарактеризованная модель истощения фолликула, при которой молодым взрослым самшам вводили разовую дозу циклофосфамидной химиотерапии, или солевой контроль транспортного средства (n’5/group), и оба яичника были собраны с каждого животного после 48 часов. Один яичн…

Discussion

В этой статье приводится пошаговой протокол для техники золотого стандарта для перечисления мышей изначальных фолликулов, стереологии и более часто используемого метода прямого подсчета фолликулов. Химиотерапия была использована для сравнения и контраста результаты, полученные из ?…

Materials

1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL