पेट के कैंसर स्टेम सेल का अध्ययन करने के लिए स्फेरॉइड का एक त्रि-आयामी मॉडल
Summary
यह प्रोटोकॉल Caco2 पेट एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से त्रि-आयामी स्फेरॉइड उत्पन्न करने और विकसित करने के लिए एक उपन्यास, मजबूत और प्रजनन योग्य संस्कृति प्रणाली प्रस्तुत करता है। परिणाम कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रिया सहित कैंसर स्टेम सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता के लिए पहली सबूत की अवधारणा प्रदान करते हैं ।
Abstract
कोलोरेक्टल कैंसर विषमता और एक पदानुक्रमित संगठन की विशेषता है जिसमें ट्यूमर के विकास, रखरखाव और दवाओं के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की आबादी शामिल है। इसलिए, उनके विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए सीएससी गुणों की बेहतर समझ प्रभावी चिकित्सा के लिए एक पूर्व-अपेक्षित है। हालांकि, गहराई से जांच के लिए उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडलों की कमी है । हालांकि इन विट्रो टू-डायमेंशनल (2डी) कैंसर सेल लाइनें ट्यूमर जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं, लेकिन वे फेनोटाइपिक और जेनेटिक ट्यूमर विषमता को दोहराने नहीं देती हैं। इसके विपरीत, त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल निकट-शारीरिक कैंसर जटिलता और कोशिका विषमता को संबोधित और पुन: पेश करते हैं। इस काम का उद्देश्य सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और प्रजनन योग्य 3 डी संस्कृति प्रणाली डिजाइन करना था। वर्तमान पद्धति 3 डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए शर्तों के विकास और अनुकूलन का वर्णन करती है, जो आकार में समरूप हैं, Caco2 कोलन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से, एक मॉडल जिसका उपयोग दीर्घकालिक संस्कृति के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि स्फेरॉइड के भीतर, ल्यूमेन जैसी संरचनाओं के आसपास आयोजित कोशिकाओं को अंतर कोशिका प्रसार पैटर्न और मार्कर के एक पैनल को व्यक्त करने वाले सीएससी की उपस्थिति की विशेषता थी। ये परिणाम कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया सहित सेल विषमता और सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस 3 डी दृष्टिकोण की उपयुक्तता के लिए पहला सबूत-अवधारणा प्रदान करते हैं।
Introduction
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया में कैंसर से जुड़ी मौतों का दूसरा प्रमुख कारण बना हुआ है1। सीआरसी का विकास एक प्रगतिशील अधिग्रहण और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और/या एपिजेनेटिक परिवर्तन2,3के संचय का परिणाम है, जिसमें ऑन्कोजीन की सक्रियता और ट्यूमर दबाने वाले जीन3,4की निष्क्रियता शामिल है । इसके अलावा, गैर-आनुवंशिक कारक (उदाहरण के लिए, माइक्रोएनवायरमेंट) ऑन्कोजेनिक परिवर्तन में योगदान और बढ़ावा दे सकते हैं और इस प्रकार सीआरसी5के विकास में भाग लेते हैं। महत्वपूर्ण बात, सीआरसी विभिन्न कोशिका आबादी से बना है, जिसमें कुछ भेदभाव लक्षण प्रदर्शित करने वाले अविभेदित सीएससी और थोक ट्यूमर कोशिकाएं शामिल हैं, जो एक सामान्य कोलोन क्रिप्ट6, 7में एपिथेलियम के संगठन की याद ताजा करने वाली एक पदानुक्रमित संरचना कागठनकरती हैं।
सीसीएस को ट्यूमर उपस्थिति8, इसकेरखरखाव और विकास, मेटास्टैटिक क्षमता और पारंपरिक उपचारों के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार माना जाता है6,7। ट्यूमर के भीतर, सीएससी सहित कैंसर कोशिकाएं, अपने अलग उत्परिवर्तनीय और एपिजेनेटिक प्रोफाइल, रूपात्मक और फेनोटाइपिक मतभेदों, जीन अभिव्यक्ति, चयापचय, प्रसार दरों और मेटास्टैटिक क्षमता9के संदर्भ में उच्च स्तर की विषमता और जटिलता प्रदर्शित करती हैं। इसलिए, कैंसर जीव विज्ञान, ट्यूमर प्रगति, और चिकित्सा के प्रतिरोध के अधिग्रहण और प्रभावी उपचारों में इसके अनुवाद को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इस कैंसर विषमता और पदानुक्रम पर कब्जा करने वाले मानव प्रीक्लिनिकल मॉडल महत्वपूर्ण हैं10,11।
इन विट्रो 2 डी कैंसर सेल लाइनों का उपयोग लंबे समय तक किया जाता रहा है और ट्यूमर के विकास और चिकित्सीय अणुओं की प्रभावकारिता में अंतर्निहित तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, मूल ट्यूमर में पाए जाने वाले फेनोइपिक और आनुवंशिक विषमता की कमी के संबंध में उनकी सीमा अब व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है12। इसके अलावा, पोषक तत्व, ऑक्सीजन, पीएच ग्रेडिएंट, और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट पुन: उत्पन्न नहीं होते हैं, माइक्रोएनवायरमेंट सीएससी11, 12सहित विभिन्न सेल प्रकारों के रखरखाव के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इन मुख्य कमियों को दूर करने के लिए, कई 3 डी मॉडलों को प्रायोगिक रूप से पता लगाने और कैंसर की जटिलता और विषमता को पुन: पेश करने के लिए विकसित किया गया है। वास्तव में, ये मॉडल ट्यूमर सेलुलर विषमता, सेल-सेल इंटरैक्शन और स्थानिक वास्तुकला का पुनर्पूंजीकरण करते हैं, जो वीवो12,13,14में मनाए गए लोगोंकेसमान हैं। ताजा ट्यूमर से स्थापित प्राथमिक ट्यूमर ऑर्गेनॉइड, साथ ही सेल लाइन-व्युत्पन्न स्फेरॉइड, मोटे तौर पर15, 16 कार्यरतहैं।
कोशिकाओं को कोशिकाओं को बनाने और कोशिका समुच्चय में बढ़ने के लिए मजबूर करने के लिए स्पेरोइड को पाड़-मुक्त या पाड़-आधारित तरीके से सुसंस्कृत किया जा सकता है। पाड़ मुक्त विधियां गैर-अनुयायी स्थितियों (उदाहरण के लिए, फांसी-ड्रॉप विधि या अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट्स) के तहत कोशिकाओं की संस्कृति पर आधारित होती हैं, जबकि पाड़ आधारित मॉडल प्राकृतिक, सिंथेटिक या हाइब्रिड बायोमैटेरियल्स पर संस्कृति कोशिकाओंको 12,13,14पर भरोसा करते हैं। पाड़ आधारित गोलाकार विभिन्न नुकसान पेश करते हैं क्योंकि अंतिम स्फेरॉइड गठन (जैव) सामग्री की प्रकृति और संरचना पर निर्भर करेगा। यद्यपि अब तक उपलब्ध पाड़ मुक्त गोलाकार विधियां सब्सट्रेट की प्रकृति पर निर्भर नहीं करती हैं, फिर भी वे स्फेरॉइड उत्पन्न करते हैं जो संरचना और आकार17,18में भिन्न होते हैं।
इस काम का उद्देश्य स्फेरॉइड की एक मजबूत और प्रजनन योग्य 3 डी संस्कृति प्रणाली तैयार करना था, जो आकार में समरूप हैं, जो सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए Caco2 पेट एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से बना है। Caco2 कोशिकाओं को अपनी क्षमता के कारण विशेष रूप से समय19,20के साथ अंतर करने केलिए,दृढ़ता से एक स्टेम की तरह क्षमता का सुझाव है । तदनुसार, स्फेरॉइड की दीर्घकालिक संस्कृति ने कीमोथेरेपी के लिए विभिन्न प्रतिक्रियाओं के साथ विभिन्न सीएससी आबादी की उपस्थिति का खुलासा किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो 3 डी मॉडल 2D कैंसर सेल संस्कृतियों की मुख्य प्रयोगात्मक कमियों को दूर करते हैं, क्योंकि वे माइक्रोएनवायरमेंट और सेल विषमता सहित विशिष्ट ट्यूमर सुविधाओं को फिर से पंजा लगाने में अधिक विश्वसनी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेजिंग और एनिवरथ रिचेचे हॉटोलॉजी प्लेटफॉर्म (सीआरसीएल, सीएलबी) को स्वीकार करते हैं। हम फोलफॉक्स और फोलफिरी के तरह के उपहार के लिए सेंटर लेओन बेरार्ड (सीएलबी) अस्पताल की फार्मेसी के ऋणी हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ब्रिजित मैनशिप का भी शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एफआरएम (इक्विज एफआरएम 2018, DEQ20181039598) और इंका (PLBIO19-289) द्वारा समर्थित किया गया था। एमवीजी और एलसी को एफआरएम से समर्थन मिला और सीएफ को एआरसी फाउंडेशन और सेंटर लेओन बेरार्ड से समर्थन मिला।
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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