Determinación rápida de la afinidad anticuerpos-antígenos por fotometría de masas

Summary

Describimos un enfoque de una sola molécula para las mediciones de afinidad antígeno-anticuerpo utilizando fotometría de masas (MP). El protocolo basado en MP es rápido, preciso, utiliza una cantidad muy pequeña de material y no requiere modificación de proteínas.

Abstract

Las mediciones de la especificidad y afinidad de las interacciones antígeno-anticuerpos son de vital importancia para aplicaciones médicas y de investigación. En este protocolo, describimos la implementación de una nueva técnica de una sola molécula, la fotometría de masas (MP), para este propósito. MP es una técnica libre de etiquetas e inmovilización que detecta y cuantifica las masas moleculares y las poblaciones de anticuerpos y complejos antigen-anticuerpos a nivel de una sola molécula. MP analiza la muestra de antígeno-anticuerpo en cuestión de minutos, permitiendo la determinación precisa de la afinidad de unión y proporcionando simultáneamente información sobre la estequiometría y el estado oligomérico de las proteínas. Esta es una técnica simple y directa que requiere sólo cantidades de picomole de proteína y no consumibles caros. El mismo procedimiento se puede utilizar para estudiar la unión proteína-proteína para proteínas con una masa molecular superior a 50 kDa. Para las interacciones multivalentes de proteínas, las afinidades de múltiples sitios de unión se pueden obtener en una sola medición. Sin embargo, el modo de medición de una sola molécula y la falta de etiquetado imponen algunas limitaciones experimentales. Este método da los mejores resultados cuando se aplica a mediciones de affinidades de interacción submicromolar, antígenos con una masa molecular de 20 kDa o más grandes, y muestras de proteínas relativamente puras. También describimos el procedimiento para realizar los pasos de ajuste y cálculo necesarios utilizando el software básico de análisis de datos.

Introduction

Los anticuerpos se han convertido en herramientas omnipresentes de la biología molecular y se utilizan ampliamente en aplicaciones médicas y de investigación. En medicina, son de vital importancia en el diagnóstico, pero sus aplicaciones terapéuticas también se están expandiendo y constantemente se desarrollan nuevas terapias basadas en anticuerpos^1,2,3,4. Las aplicaciones científicas de los anticuerpos incluyen muchas técnicas de laboratorio indispensables como la inmunofluorescencia^5,la inmunoprecipitación^6,la citometría de flujo^7,ELISA e hinchazón occidental. Para cada una de estas aplicaciones, es de crucial importancia obtener mediciones precisas de las propiedades de unión del anticuerpo, incluida la afinidad y especificidad de unión.

Desde que se introdujo el primer instrumento de resonancia de plasmon de superficie comercial (SPR) en 1990, los biosensores ópticos se han convertido en el “estándar de oro” de caracterización de anticuerpos, pero otras técnicas, incluyendo ELISA, también se utilizan rutinariamente para medir las afinidades de anticuerpos^8,9. Estos métodos generalmente requieren inmovilización o etiquetado de las moléculas analizadas, lo que puede afectar potencialmente la interacción de interés. También son relativamente lentos, lo que implica varios pasos de ensayo antes de que los resultados se puedan recopilar para el análisis de datos. Un método de una sola molécula desarrollado recientemente, la fotometría de masas (MP), detecta moléculas directamente en la solución cuando aterrizan en la superficie del microscopio cubrep^10,11. La detección óptica basada en dispersión de luz que emplea MP no requiere etiquetado o modificación de proteínas. Las moléculas de proteínas individuales se registran mediante el microscopio de dispersión interferométrico como manchas oscuras que aparecen en la imagen(Figura 1D),y varios miles de moléculas se pueden detectar durante la adquisición de datos de un minuto¹². La señal generada por cada partícula individual se cuantifica y se calcula su valor de contraste (oscuridad relativa). Los valores de contraste interferométrico son proporcionales a las masas moleculares de las proteínas, lo que permite la identificación de especies unidas y libres en la mezcla antígeno-anticuerpo. Al mismo tiempo, contando los eventos de aterrizaje molecular, MP mide directamente las poblaciones de especies. Esto proporciona a los métodos basados en MP una capacidad única para cuantificar de forma independiente las afines de varios sitios de enlace.

La unión de las moléculas de antígeno (Ag) a los dos sitios de unión del anticuerpo intacto (Ab) se puede describir como:

con las constantes de asociación de equilibrio K_a1 y K_a2 definidas como:

donde c_i y f_i representan la concentración y fracción del componente i, respectivamente. La concentración total de antígenos (c_Ag)_tot puede expresarse como:

Dado que se conocen las concentraciones totales del anticuerpo (c_Ab)_tot y antígeno (c_Ag)_tot, esta ecuación se puede utilizar para ajustar directamente las fracciones de componentes experimentales obtenidas de las mediciones MP y calcular las constantes de asociación de equilibrio K_a1 y K_a2 (ver Información complementaria).

Los datos MP también se pueden utilizar para estimar la cooperatividad entre los dos sitios de unión de anticuerpos¹¹. Para dos paratopos de anticuerpos con constantes de unión microscópicas idénticas, los factores estadísticos que describen el proceso de población de la Ab Ag y Ab? Loscomplejos Ag₂ dictan que las constantes de equilibrio macroscópicas aparentes K_a1 y K_a2 no serán numéricamente iguales, y K_a1 a 4K_a2. Por lo tanto, los valores experimentales de K_a1 < 4K_a2 indican una cooperación positiva entre los dos sitios de unión de anticuerpos. Del mismo modo, K_a1 > 4K_a2 indica una cooperación negativa.

Las mediciones MP de la afinidad de unión antígeno-anticuerpo son rápidas y requieren una pequeña cantidad de material. Las distribuciones de masa MP utilizadas para los cálculos constantes de equilibrio proporcionan información adicional sobre las propiedades de la muestra y permiten la evaluación de la pureza, la oligomerización y la agregación de la muestra en un solo experimento. El mismo método se puede utilizar para medir la unión entre proteínas y proteínas de alta afinidad, y MP es particularmente útil para estudios de interacciones multi-variables de proteínas. Los complejos multi proteico suelen tener grandes masas moleculares, óptimas para la detección de MP, y los datos de una sola molécula se pueden utilizar para medir la estequiometría y calcular las afinidades de múltiples sitios de unión simultáneamente. Esta información suele ser difícil de obtener mediante métodos basados en masa.

Sin modificaciones, el protocolo actual es adecuado para mediciones de interacciones submicromolares de relativamente alta afinidad con antígenos de una masa molecular de 20 kDa o más. Para obtener resultados óptimos, las existencias de proteínas deben ser de alta pureza, pero no hay requisitos específicos de amortiguación. Mediante el uso de MP, la unión antígeno-anticuerpos se puede evaluar en menos de cinco minutos. La recopilación y el análisis de datos necesarios para cálculos K_d precisos se pueden realizar en un plazo de 30 minutos.

Protocol

1. Prepare las cámaras de flujo Limpie los cubreobjetos de vidrio Usando botellas de lavado con agua destilada, etanol e isopropanol, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en el siguiente orden: agua, etanol, agua, isopropanol, agua. Seque los cubreobjetos con una corriente de nitrógeno limpio. Es importante enjuagar los cubreobjetos de arriba a abajo, sosteniendo la esquina inferior con fórceps de punta suave. Seque el cubreobjetos en la misma dirección para evitar la transferencia de contamin…

Representative Results

Hemos examinado previamente la interacción del α-trombina humana (HT) y del anticuerpo monoclonal antihumano de ratón (AHT) utilizando el ensayo basado en MP11. Dado que la masa molecular del HT (37 kDa) está por debajo del límite de detección de 40 kDa, la concentración máxima de la muestra puede superar la limitación de concentración de MP de 50 nM sin afectar negativamente a la resolución de distribuciones de masas. El experimento se planeó como una serie de valoración con el antic…

Discussion

El protocolo basado en fotometría de masas descrito aquí proporciona un método rápido y preciso para medir las afinidades de unión de anticuerpos antigen. El análisis de MP utiliza una cantidad muy pequeña de material, y la información adicional, incluida la estequiometría, la oligomerización y la pureza, se puede evaluar a partir de los mismos datos (Figura 5). Sin modificaciones, este método es aplicable a las mediciones de constantes de disociación en el rango de aproximadamen…

Materials

AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24×24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24×50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering