ניתוח רפרטואר חיסוני של קולטן תאי T ו- B באמצעות רצף הדור הבא
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד DNA מדגימות דם וביופסיות מעיים, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR לריצוף הדור הבא, ביצועים של ריצת NGS וניתוח נתונים בסיסי.
Abstract
זיכרון אימונולוגי, סימן ההיכר של חסינות אדפטיבית, מתוזמר על ידי לימפוציטים T ו- B. במחזור ובאיברים שונים, ישנם מיליארדי שיבוטים ייחודיים של תאי T ו- B, וכל אחד מהם יכול לקשור אנטיגן ספציפי, המוביל לשגשוג, בידול ו/או הפרשת ציטוקינים. ההטרוגניות העצומה בתאי T ו- B נוצרת על ידי שילוב אקראי של מקטעים גנטיים שונים. טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS), שפותחו בעשור האחרון, מאפשרות מבט מעמיק וחסר תקדים על הרפרטואר החיסוני של קולטן תאי T ו-B. מחקרים במצבים דלקתיים שונים, כשל חיסוני, זיהומים וממאירות הראו שינויים ניכרים בשיבוטיות, בשימוש בגנים ובתכונות ביופיזיות של רפרטואר מערכת החיסון, וסיפקו תובנות חשובות על תפקידן של תגובות חיסוניות מסתגלות בהפרעות שונות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור NGS של רפרטואר המערכת החיסונית של תאי T ו- B מן הדם והרקמות. אנו מציגים צינור החל מבידוד DNA דרך הכנת הספרייה, רצף על רצף NGS וכלה בניתוחים בסיסיים. שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו, ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרים של גיוון במחלות שונות. טכניקה זו נכנסת לאט לפרקטיקה הקלינית ויש לה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים, ריבוד סיכונים ורפואה מדויקת.
Introduction
המערכת החיסונית האדפטיבית, המורכבת מלטמפוציטים T ו- B, משתמשת בזיכרון אימונולוגי כדי לזהות אנטיגן שנתקל בעבר וליזום תגובה מהירה. לימפוציטים נוצרים במח העצם ומתבגרים בתימוס (תאי T) או במח העצם (תאי B). הן קולטן תאי T (TCR) והן קולטן תא B (BCR) מציגים תצורות ייחודיות המאפשרות זיהוי של אנטיגנים ספציפיים. בתאי הומאוסטזיס, תאי T ו- B מסתובבים כל הזמן וסוקרים את טריליוני הפפטידים השונים המוצגים על תאים המציגים אנטיגן. TCR או קשירת BCR של אנטיגן מסוים עם זיקה גבוהה, יחד עם גירוי משותף מתאים, מוביל להפעלת תאים, וכתוצאה מכך הפרשת ציטוקינים, הרחבת שיבוטים ויצירת נוגדנים, במקרה של תאי B.
המערך העצום של תאי T או B השונים נקרא באופן קולקטיבי רפרטואר חיסוני, המאפשר הכרה באינספור אפיטופים שונים. על מנת ליצור רפרטואר כה עצום, מתרחש תהליך מורכב של הרכבה אקראית של מקטעי גנים שונים, ויוצר שילובים כמעט אינסופיים של קולטנים שיכולים לקשור אנטיגנים ייחודיים1. תהליך זה, הנקרא V(D)J recombination, כולל סידורים מחדש של משתנים שונים (V), גיוון (D) והצטרפות (J) גנים, מלווה מחיקות אקראיות והכנסות של נוקלאוטידים בצמתים2.
הארכיטקטורה של מערכת החיסון האדפטיבית עניינה מדענים בתחומים שונים במשך עשורים רבים. בעבר, רצף סנגר, קביעת אזור משלים 3 (CDR3) ספקטרtyping, ואת cytometry זרימה שימשו כדי לאפיין את הרפרטואר החיסוני, אבל סיפק רזולוציה נמוכה. בעשור האחרון, ההתקדמות בשיטות רצף הדור הבא (NGS) אפשרה תובנה מעמיקה על המאפיינים וההרכב של רפרטואר TCR ו- BCR של הפרט3,4. מערכות תפוקה גבוהה אלה (HTS) רצף ומעבד מיליוני מוצרי TCR או BCR מסודרים מחדש בו זמנית ולאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאי T ו- B ספציפיים ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. NGS מספק אסטרטגיה חדשה לחקר הרפרטואר החיסוני הן בבריאות והן במחלות. מחקרים העושים שימוש ב- HTS הדגימו רפרטואר TCR ו- BCR שונה במחלות אוטואימוניות5, כשל חיסוני ראשוני6,7, וממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה8. באמצעות NGS, אנו ואחרים הראו התרחבות אוליגוקלונית של שיבוטים ספציפיים של תאי T ו- B, בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן9,10,11,12,13,14. בסך הכל, מחקרים מתחומים שונים מראים שלשינויים ברפרטואר יש תפקיד מכריע בפתוגנזה של הפרעות בתיווך חיסוני.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד דנ”א מביופסיות מעיים ודם, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR עבור NGS וביצוע ריצוף ריצה. אנו מספקים גם שלבים בסיסיים בניתוח נתונים של רפרטואר חיסוני. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור הדור של ספריות TCRα, TCRγ, ו IGL גם כן. השיטה תואמת גם לאיברים אחרים (למשל, בלוטות לימפה, גידולים, נוזל סינוביאלי, רקמת שומן וכו ‘) כל עוד נעשה שימוש בפרוטוקולי עיכול ספציפיים לרקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים בשפע ובתפקוד של לימפוציטים B ו- T נתקלים לעתים קרובות בממאירות שונות18, הפרעות דלקתיות כרוניות (למשל, קוליטיס כיבית ודלקת מפרקים שגרונית)10,19, וב immunodeficiencies שונים17,20. השיטה הנוכחית משתמשת ב- NGS כדי להקל על תצוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
