הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.
הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.
הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.
ההליך הכללי של בידוד הפטוציטים של עכברים הוא קודם כל לשטוף את הדם בכבד עם נוזל איזוסמוטי כגון מלח בחסימת פוספט (PBS) או תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחר מכן להשתמש בתמיסה המכילה קולגן כדי לנתק הפטוציטים. פרוטוקולים אלה חולקים הליך כללי אך נבדלים זה מזה בריאגנטים ובשלבים בהתאם לצרכים שונים. עם זאת, הכנת ריאגנטים נדרשים וביצוע צעדי בידוד לוקחים זמן. בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, היעילות נקבעה כעדיפות, כאשר כל הריאגנטים מוכנים לשימוש וזמינים מהשוק, וכמה שפחות צעדים. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ויעילה לעבודה כדי לבודד הפטוציטים ראשוניים מעכבר, מבלי לסכן את טוהר הפטוציטים ראשוני מבודדים ואת הכדאיות.
פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.
ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).
1x PBS | Gibco | 10010023 | |
10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Liver Digest MA2:D30edium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |