Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris
Summary
Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.
Abstract
Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche in vitro sur le foie, en particulier dans les études sur le métabolisme du glucose. Une technique de base a été adaptée en fonction de différents besoins, tels que le temps, la main-d’œuvre, le coût et l’utilisation primaire des hépatocytes, ce qui a donné lieu à divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires. Cependant, les nombreuses étapes et les préparations de réactifs fastidieuses dans l’isolement des hépatocytes primaires sont des inconvénients majeurs pour l’efficacité. Après avoir comparé différents protocoles pour leurs avantages et leurs inconvénients, les avantages de chacun ont été combinés et un protocole d’isolement hépatocytaire primaire rapide et efficace a été formulé. En seulement ~ 35 minutes, ce protocole pourrait produire autant, sinon plus, d’hépatocytes primaires sains que d’autres protocoles. De plus, des expériences sur le métabolisme du glucose réalisées à l’aide des hépatocytes primaires isolés ont validé l’utilité de ce protocole dans les études in vitro sur le métabolisme hépatique. Nous avons également examiné et analysé de manière approfondie l’importance et le but de chaque étape de cette étude afin que les futurs chercheurs puissent optimiser davantage ce protocole en fonction des besoins.
Introduction
Le foie est l’un des organes les plus importants du corps des vertébrés en raison du rôle vital qu’il joue dans de nombreuses fonctions vitales telles que la digestion des aliments, la circulation sanguine et la désintoxication. L’utilisation de la culture in vitro d’hépatocytes primaires de souris est de plus en plus populaire dans les études sur le métabolisme des glucides et le carcinome hépatique. Par conséquent, il est important de développer une méthode pratique pour l’isolement des hépatocytes primaires de souris tout en maintenant sa fonction physiologique innée. En raison de sa fonction de plaque tournante du métabolisme du glucose, le foie est également au cœur de la production et du stockage du glucose1. Les expériences avec des hépatocytes primaires in vitro sont indispensables à la plupart des études sur le métabolisme du glucose. Par conséquent, pendant des années, divers groupes de recherche ont développé des protocoles pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris.
La procédure générale d’isolement des hépatocytes de souris consiste d’abord à rincer le sang dans le foie avec un liquide isosmotique tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), puis à utiliser une solution contenant de la collagénase pour dissocier les hépatocytes. Ces protocoles partagent une procédure générale, mais diffèrent par des réactifs et des étapes en fonction de différents besoins. Cependant, la préparation des réactifs requis et l’exécution des étapes d’isolement prennent du temps. Lors de l’élaboration du protocole actuel, l’efficacité a été une priorité, avec tous les réactifs prêts à l’emploi et disponibles sur le marché, et le moins d’étapes possible. L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode rapide et efficace en main-d’œuvre pour isoler les hépatocytes primaires de la souris, sans compromettre la pureté et la viabilité des hépatocytes primaires isolés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires ont été développés. Ils ont également été optimisés et adaptés en fonction des différents besoins (tableau 1). Les protocoles d’isolement sont généralement composés de deux parties : la perfusion (y compris la digestion enzymatique) et la purification.
La perfusion peut être réalisée avec l’ensemble du foie in vivo 2,20,21,22,23 ou …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Subvention 5R01HD095512-02 à S.W.).
Materials
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest MA2:D30edium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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