마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜
Summary
원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.
Abstract
원발성 간세포는 시험관내 간 연구, 특히 포도당 대사 연구에서 광범위하게 사용된다. 기본 기술은 시간, 노동, 비용 및 원발성 간세포 사용과 같은 다양한 요구에 따라 적용되어 다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜을 초래합니다. 그러나, 원발성 간세포 단리에서의 수많은 단계 및 시간 소모적인 시약 제제는 효율성을 위한 주요한 단점이다. 장단점에 대해 서로 다른 프로토콜을 비교 한 후 각각의 장점을 결합하고 신속하고 효율적인 원발성 간세포 분리 프로토콜을 공식화했습니다. 불과 ~ 35 분 이내에이 프로토콜은 다른 프로토콜만큼 건강한 원발성 간세포를 산출 할 수 있습니다. 또한, 분리된 원발성 간세포를 사용하여 수행된 글루코스 대사 실험은 시험관내 간 대사 연구에서 이러한 프로토콜의 유용성을 검증하였다. 우리는 또한이 연구의 각 단계의 중요성과 목적을 광범위하게 검토하고 분석하여 미래의 연구자가 필요에 따라이 프로토콜을 더욱 최적화 할 수 있도록했습니다.
Introduction
간은 음식 소화, 혈액 순환 및 해독과 같은 수많은 생명 유지 기능에서 중요한 역할을하기 때문에 척추 동물의 신체에서 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 시험관내 배양에서 마우스 원발성 간세포의 사용은 탄수화물 대사 및 간 암종에 대한 연구에서 점점 더 대중화되고 있다. 따라서, 마우스의 선천적 생리적 기능을 유지하면서 원발성 간세포를 분리하기 위한 편리한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 포도당 대사의 허브로서의 기능으로 인해 간은 포도당 생산 및 저장의 중심이기도합니다1. 시험관 내에서 원발성 간세포를 이용한 실험은 대부분의 포도당 대사 연구에 필수적이다. 따라서 수년 동안 다양한 연구 그룹이 마우스 원발성 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다.
마우스 간세포 분리의 일반적인 절차는 먼저 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)과 같은 이소형 액체로 간에서 혈액을 씻어 낸 다음 콜라게나제 함유 용액을 사용하여 간세포를 해리시키는 것입니다. 이러한 프로토콜은 일반적인 절차를 공유하지만 필요에 따라 시약과 단계가 다릅니다. 그러나 필요한 시약을 준비하고 분리 단계를 수행하는 데는 시간이 걸립니다. 본 프로토콜을 개발할 때, 효율성은 우선 순위로 설정되었으며, 모든 시약은 즉시 사용 가능하고 시장에서 구입할 수 있으며 가능한 한 적은 단계였습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 단리된 원발성 간세포의 순도 및 생존력을 위태롭게 하지 않으면서 마우스로부터 원발성 간세포를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
Protocol
모든 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스(8주령)를 본 연구에 사용하였다. 1. 준비: 윌리엄의 E 배지 (GlutaMAX 보충제)를 10 % FBS 및 1 % 항생제 – 항균제 용액과 혼합하여 배양 배지를 만듭니다. 25 mL의 콜라게나제-디스파제 배지 (예를 들어, 간 소화 배지)를 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 입자 파편…
Representative Results
효율을 시험하기 위하여, 본원의 일차 간세포 분리 프로토콜이 8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행되었다. 분리된 원발성 간세포의 부착 및 순도를 시험하였다. 원발성 간세포 분리는 간 약물 효과 및 글루코스 대사, 제약 바이오마커 활성2, 인슐린 감수성 및 글루코스 생산과 같은 간 생리학에 대한 매우 다양한 실험에 사용된다. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 원발성 간세포의…
Discussion
다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜이 개발되었다. 또한 다양한 요구에 따라 최적화되고 조정되었습니다 (표 1). 분리 프로토콜은 일반적으로 관류 (효소 소화 포함)와 정제의 두 부분으로 구성됩니다.
관류는 생체내 전체 간(2,20,21,22,23) 또는 해부된 간엽(2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)의 지원을 받았다.
Materials
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest MA2:D30edium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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Cite This Article
Feng, M., Divall, S., Wu, S. An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation. J. Vis. Exp. (176), e61812, doi:10.3791/61812 (2021).