Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus
Summary
Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.
Abstract
Primäre Hepatozyten werden in der Leber-in-vitro-Forschung , insbesondere in Glukosestoffwechselstudien, umfassend eingesetzt. Eine Basistechnik wurde basierend auf verschiedenen Anforderungen wie Zeit, Arbeit, Kosten und primärer Hepatozytennutzung angepasst, was zu verschiedenen primären Hepatozytenisolationsprotokollen führte. Die zahlreichen Schritte und zeitaufwändigen Reagenzienpräparate in der primären Hepatozytenisolierung sind jedoch große Nachteile für die Effizienz. Nach dem Vergleich verschiedener Protokolle für ihre Vor- und Nachteile wurden die Vorteile jedes Protokolls kombiniert und ein schnelles und effizientes primäres Hepatozytenisolationsprotokoll formuliert. Innerhalb von nur ~ 35 Minuten könnte dieses Protokoll genauso viel, wenn nicht mehr, gesunde primäre Hepatozyten liefern wie andere Protokolle. Darüber hinaus validierten Glukosestoffwechselexperimente, die mit den isolierten primären Hepatozyten durchgeführt wurden, die Nützlichkeit dieses Protokolls in In-vitro-Leberstoffwechselstudien . Wir haben auch die Bedeutung und den Zweck jedes Schritts in dieser Studie ausführlich überprüft und analysiert, damit zukünftige Forscher dieses Protokoll basierend auf den Bedürfnissen weiter optimieren können.
Introduction
Die Leber dient als eines der wichtigsten Organe im Wirbeltierkörper aufgrund der lebenswichtigen Rolle, die sie bei zahlreichen lebenserhaltenden Funktionen wie Nahrungsverdauung, Durchblutung und Entgiftung spielt. Die Verwendung von primären Hepatozyten in vitro-Kulturen der Maus wird in Studien zum Kohlenhydratstoffwechsel und zum Leberkarzinom immer beliebter. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode zur primären Hepatozytenisolierung der Maus zu entwickeln und gleichzeitig ihre angeborene physiologische Funktion beizubehalten. Aufgrund ihrer Funktion als Drehscheibe des Glukosestoffwechsels ist die Leber auch für die Glukoseproduktion und -speicherungvon zentraler Bedeutung 1. Experimente mit primären Hepatozyten in vitro sind ein Muss für die meisten Glukosestoffwechselstudien. Daher haben verschiedene Forschungsgruppen seit Jahren Protokolle für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.
Das allgemeine Verfahren der Hepatozytenisolierung der Maus besteht darin, zuerst Blut in der Leber mit einer isosmotischen Flüssigkeit wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) auszuspülen und dann Kollagenase-haltige Lösung zu verwenden, um Hepatozyten zu dissoziieren. Diese Protokolle teilen sich ein allgemeines Verfahren, unterscheiden sich jedoch in Reagenzien und Schritten, die auf unterschiedlichen Anforderungen basieren. Die Vorbereitung der erforderlichen Reagenzien und die Durchführung von Isolationsschritten nehmen jedoch Zeit in Anspruch. Bei der Entwicklung des vorliegenden Protokolls wurde die Effizienz als Priorität festgelegt, wobei alle Reagenzien gebrauchsfertig und auf dem Markt erhältlich sind, und zwar in so wenigen Schritten wie möglich. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle und arbeitseffiziente Methode zur Isolierung primärer Hepatozyten von der Maus bereitzustellen, ohne die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter primärer Hepatozyten zu gefährden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene primäre Hepatozytenisolationsprotokolle wurden entwickelt. Sie wurden auch optimiert und an unterschiedliche Bedürfnisse angepasst (Tabelle 1). Isolationsprotokolle bestehen im Allgemeinen aus zwei Teilen: Perfusion (einschließlich Enzymaufschluss) und Reinigung.
Die Perfusion kann mit der gesamten Leber in vivo 2,20,21,22,23 oder mit sezierten Leberlappen <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.) unterstützt.
Materials
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest MA2:D30edium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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