Primære hepatocytter er et værdifuldt redskab til at studere leverrespons og metabolisme in vitro. Ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser blev der udviklet en forbedret tids- og arbejdseffektiv protokol til musens primære hepatocytisolering.
Primære hepatocytter anvendes i vid udstrækning i leverin vitro-forskning , især i glukosemetabolismeundersøgelser. En basisteknik er blevet tilpasset baseret på forskellige behov, som tid, arbejdskraft, omkostninger og primær hepatocytbrug, hvilket resulterer i forskellige primære hepatocytisoleringsprotokoller. Imidlertid er de mange trin og tidskrævende reagenspræparater i primær hepatocytisolering store ulemper for effektiviteten. Efter at have sammenlignet forskellige protokoller for deres fordele og ulemper blev fordelene ved hver enkelt kombineret, og en hurtig og effektiv primær hepatocytisoleringsprotokol blev formuleret. Inden for kun ~ 35 minutter kunne denne protokol give lige så meget, hvis ikke mere, sunde primære hepatocytter som andre protokoller. Endvidere validerede glukosemetabolismeforsøg udført ved anvendelse af de isolerede primære hepatocytter nytten af denne protokol i in vitro-levermetabolismeundersøgelser . Vi gennemgik og analyserede også i vid udstrækning betydningen og formålet med hvert trin i denne undersøgelse, så fremtidige forskere yderligere kan optimere denne protokol baseret på behov.
Leveren tjener som et af de vigtigste organer i hvirveldyrets krop på grund af den afgørende rolle, den spiller i mange livsstøttende funktioner som fordøjelse af mad, blodcirkulation og afgiftning. Brug af musens primære hepatocyt in vitro-kultur bliver stadig mere populær i undersøgelser af kulhydratmetabolisme og leverkarcinom. Derfor er det vigtigt at udvikle en bekvem metode til musens primære hepatocytisolering, samtidig med at den medfødte fysiologiske funktion opretholdes. På grund af sin funktion som et knudepunkt for glukosemetabolisme er leveren også central for glukoseproduktion og opbevaring1. Eksperimenter med primære hepatocytter in vitro er et must for de fleste glukosemetabolismeundersøgelser. Derfor har forskellige forskergrupper i årevis udviklet protokoller til musenes primære hepatocytisolering.
Den generelle procedure for musehpatocytisolering er først at skylle blod ud i leveren med en isosmotisk væske, såsom fosfatbufret saltvand (PBS) eller Hanks ‘Balanced Salt Solution (HBSS) og derefter bruge collagenaseholdig opløsning til dissociere hepatocytter. Disse protokoller deler en generel procedure, men adskiller sig i reagenser og trin baseret på forskellige behov. Det tager dog tid at forberede nødvendige reagenser og udføre isolationstrin. Ved udviklingen af denne protokol blev effektivitet sat som en prioritet, idet alle reagenser var klar til brug og tilgængelige fra markedet og så få trin som muligt. Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en hurtig og arbejdseffektiv metode til at isolere primære hepatocytter fra mus uden at bringe den isolerede primære hepatocytrenhed og levedygtighed i fare.
Forskellige primære hepatocytisoleringsprotokoller er blevet udviklet. De er også blevet holdt optimeret og tilpasset ud fra forskellige behov (tabel 1). Isolationsprotokoller er generelt sammensat af to dele: perfusion (herunder enzymfordøjelse) og oprensning.
Perfusionen kan udføres med hele leveren in vivo 2,20,21,22,23 eller med dissekerede leverlapper <sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 til S.W.).
1x PBS | Gibco | 10010023 | |
10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Liver Digest MA2:D30edium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |