Segmentering av vekst av endotelceller i 6-brønnsplater på en orbital shaker for mekanobiologiske studier
Summary
Denne protokollen beskriver en beleggmetode for å begrense endotelcellevekst til et bestemt område av en 6-brønns plate for skjærspenningsapplikasjon ved hjelp av orbital shaker-modellen.
Abstract
Skjærspenning pålagt arterieveggen ved blodstrømmen påvirker endotelcellemorfologi og funksjon. Lav størrelse, oscillatoriske og flerveis skjærspenninger har alle blitt postulert for å stimulere en pro-aterosklerotisk fenotype i endotelceller, mens høy størrelse og enveis eller enaksial skjær antas å fremme endotelial homeostase. Disse hypotesene krever videre undersøkelser, men tradisjonelle in vitro-teknikker har begrensninger, og er spesielt dårlige til å pålegge flerveis skjærspenninger på celler.
En metode som får økende bruk er å dyrke endotelceller i standard multi-brønnplater på plattformen til en orbital shaker; I denne enkle, rimelige, høye gjennomstrømnings- og kroniske metoden produserer det virvlende mediet forskjellige mønstre og størrelser av skjær, inkludert flerveis skjær, i forskjellige deler av brønnen. Det har imidlertid en betydelig begrensning: celler i en region, utsatt for en type strømning, kan frigjøre mediatorer i mediet som påvirker celler i andre deler av brønnen, utsatt for forskjellige strømmer, og dermed forvrenge den tilsynelatende sammenhengen mellom strømning og fenotype.
Her presenterer vi en enkel og rimelig modifikasjon av metoden som gjør at celler bare kan eksponeres for spesifikke skjærspenningsegenskaper. Cellesåing er begrenset til en definert region av brønnen ved å belegge regionen av interesse med fibronectin, etterfulgt av passivasjon ved hjelp av passiviseringsløsning. Deretter kan platene virvles på shakeren, noe som resulterer i eksponering av celler for veldefinerte skjærprofiler som lav størrelse flerveis skjær eller høy størrelse uniaxial skjær, avhengig av deres plassering. Som før tillater bruk av standard cellekulturplastikkvare enkel videre analyse av cellene. Modifikasjonen har allerede tillatt demonstrasjon av løselige meglere, frigjort fra endotel under definerte skjærspenningsegenskaper, som påvirker celler som ligger andre steder i brønnen.
Introduction
Responser av vaskulære celler til deres mekaniske miljø er viktige i normal funksjon av blodkar og i utviklingen av sykdom1. Mekanobiologien til endotelcellene (ECs) som strekker den indre overflaten av alle blodkar har vært et spesielt fokus på mekanobiologisk forskning fordi ECs direkte opplever skjærspenningen generert av blodstrøm over dem. Ulike fenotypiske endringer som inflammatoriske responser, endret stivhet og morfologi, frigjøring av vasoaktive stoffer og lokalisering og uttrykk for koblingsproteiner avhenger av EC-eksponering for skjærspenning2,3,4. Skjæravhengige endotelegenskaper kan også redegjøre for den klumpete utviklingen av sykdommer som aterosklerose5,6,7.
Det er nyttig å studere effekten av skjær på ECs i kultur, hvor stress kan kontrolleres, og ECs kan isoleres fra andre celletyper. Vanligvis brukte in vitro-enheter for påføring av skjærspenning på ECer inkluderer parallellplatestrømningskammeret og kjegle-og-plate-viscometeret, men bare uniaxial steady, oscillatorisk og pulsatile strømning kan påføres8,9. Selv om modifiserte strømningskamre med koniske eller forgrenende geometrier og mikrofluidiske sjetonger som etterligner en stenotisk geometri er utviklet, er deres lave gjennomstrømning og den relativt korte kulturvarigheten som er mulig utgjøre en utfordring10, 11.
Orbital shaker (eller virvlende godt) metoden for studiet av endotel mechanotransduction, der celler dyrkes i standard cellekultur plasticware plassert på plattformen til en orbital shaker, får økende oppmerksomhet fordi den er i stand til kronisk imponerende komplekse, romlig varierende skjær stress mønstre på ECs med høy gjennomstrømning (se gjennomgang av Warboys et al.12). Beregningsvæskedynamikk (CFD) simuleringer har blitt brukt for å karakterisere den romlige og tidsmessige variasjonen av skjærspenning i en virvlende brønn. Den virvlende bevegelsen til kulturmediet forårsaket av shakerplattformens orbitale bevegelse der platen er plassert, fører til lav størrelses flerveis strømning (LMMF, eller putativt pro-aterogen strømning) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, eller putativt atheroprotective strømning) på kanten av brønnene til en 6-brønns plate. For eksempel er tidsgjennomsnittet veggskjærspenning (TAWSS) omtrent 0,3 Pa i midten og 0,7 Pa på kanten av en 6-brønns plate virvlet ved 150 rpm med en 5 mm orbital radius13. Metoden krever bare kommersielt tilgjengelig plasttøy og selve orbital shakeren.
Det er imidlertid en ulempe med metoden (og til andre metoder for å pålegge strømmer in vitro): ECs frigjør løselige mediatorer og mikropartikler på en skjæravhengig måte14,15,16 og dette sekretomet kan påvirke ECs i regioner i brønnen annet enn den de ble utgitt i, på grunn av blandingen i det virvlende mediet. Dette kan maskere de faktiske effektene av skjærspenning på EC fenotype. For eksempel har Ghim et al. spekulert i at dette står for den tilsynelatende identiske påvirkningen av forskjellige skjærprofiler på transcellulær transport av store partikler17.
Her beskriver vi en metode for å fremme humant navlestrengs vene endotelcelle (HUVEC) vedheft i bestemte områder av en 6-brønns plate ved hjelp av fibronektinbelegg mens du bruker Pluronic F-127 for å passivisere overflaten og forhindre vekst andre steder. Metoden løser begrensningen beskrevet ovenfor fordi EC-er ved å segmentere cellevekst bare opplever én type skjærprofil, og påvirkes ikke av sekreter fra ECer som er eksponert for andre profiler andre steder i brønnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den virvlende brønnmetoden er i stand til å generere komplekse strømningsprofiler i en enkelt brønn – Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) på kanten av brønnen. Skjærstressmediert sekreter av løselig mediator vil imidlertid bli blandet i det virvlende mediet og påvirke celler i hele brønnen, og potensielt maskere den sanne effekten av en bestemt skjærstressprofil på cellene.
Beleggmetoden som er demonstrert her, overvinner dette…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner takknemlig et British Heart Foundation-prosjektstipend (til PDW), et National Medical Research Council Singapore TAAP og DYNAMO Grant (til XW, NMRC / OFLCG/004/2018, NMRC / OFLCG/001/2017), et A * STAR Graduate Scholarship (til KTP) og et British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (til MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
