メカノ生物学的研究のための軌道シェーカー上の6ウェルプレートにおける内皮細胞の成長のセグメント化
Summary
このプロトコルは、軌道シェーカーモデルを用いた剪断応力適用用に、内皮細胞の成長を6ウェルプレートの特定の領域に制限するコーティング方法を説明する。
Abstract
血液の流れによって動脈壁に課されるせん断応力は、内皮細胞の形態および機能に影響を及ぼす。低大きさ、振動および多方向せん断応力はすべて、内皮細胞におけるプロアテローム硬化性表現型を刺激するために仮定されているのに対し、高大きさおよび単一方向または単軸せん断は内皮恒常性を促進すると考えられている。これらの仮説はさらなる調査を必要とするが、従来のインビトロ技術には限界があり、細胞に多方向せん断応力を課すのが特に不十分である。
増加する使用を増やしている方法の 1 つは、軌道シェーカーのプラットフォーム上の標準的なマルチウェル プレートで内皮細胞を培養することです。このシンプルで低コストで高スループットで慢性的な方法では、渦巻き媒体は、井戸の異なる部分に多方向せん断を含む異なるパターンとシアーの大きさを生成します。しかし、それは大きな制限を有する:ある領域の細胞は、あるタイプの流れにさらされ、異なる流れにさらされ、したがって流れと表現型の間の明らかな関係を歪める、ウェルの他の部分の細胞に影響を与える媒体にメディエーターを放出する可能性がある。
ここでは、細胞が特定のせん断応力特性にのみ露出することを可能にする方法の簡単で手頃な方法の修正を提示します。細胞の播種は、フィブロネクチンで目的領域をコーティングすることによりウェルの定義された領域に制限され、続いて、不動態の溶液を用いたパッシベーションが行われます。その後、プレートをシェーカー上で旋回させることができ、その結果、位置に応じて、低マグニチュード多方向せん断または高マグニチュード単軸せん断などの明確に定義されたせん断プロファイルに細胞が露出する。以前と同様に、標準的な細胞培養プラスチック製品を使用することで、細胞のさらなる分析が簡単になります。この改変により、定義されたせん断応力特性の下で内皮から放出された可溶性メディエーターの実証が既に可能であり、ウェル内の他の場所に位置する細胞に影響を与える。
Introduction
血管細胞の機械的環境に対する応答は、血管の正常な機能および疾患1の発症において重要である。全血管の内部表面に並ぶ血管内皮細胞(IC)のメカノバイオロジーは、その上の血流によって発生するせん断ストレスを直接経験するため、メカノ生物学的研究の特に焦点となっている。炎症性反応、変化した剛性および形態、血管活性物質の放出、および結合タンパク質の局在および発現などの様々な表現型変化は、セア応力2、3、4へのEC曝露に依存する。せん断依存性の内皮性は、アテローム性動脈硬化症5、6、7などの疾患のパッチ状の発症を考慮することもできる。
ストレスを制御できる培養物の中で、シアーが他の細胞タイプから分離できる培養物のECsに及ぼす影響を調べることができると便利です。一般的に、ECsにせん断応力を加えるために体外装置に用いられるのは、平行プレート流れチャンバーとコーンプレート粘度計を含むが、単軸定型、振動性、および拍動性流れのみが8,9に適用できる。テーパードまたは分岐形状を有する変更された流れチャンバーと、ステナティック幾何学を模倣するマイクロ流体チップが開発されているが、その低スループットおよび可能な比較的短い培養時間は、課題10、11をもたらす。
細胞が軌道シェーカーのプラットフォーム上に置かれた標準的な細胞培養プラスチック製品で成長する内皮メカノトランスダクションの研究のための軌道シェーカー(または渦巻く井戸)法は、高スループットのIC上に慢性的に複雑で空間的に変化するせん断応力パターンを押し付けることができるため、注目を集めています(Warboysらら al al.計算流体力学(CFD)シミュレーションは、渦巻く井戸のせん断応力の空間的および時間的変動を特徴付けるために採用されています。プレートが配置されたシェーカープラットフォームの軌道運動によって引き起こされる培養媒体の渦巻き運動は、6ウェルプレートのウェルの端部の中央と高マグニチュード単軸流(HMUF、または推定アテローダ保護流)の低マグニチュード多方向流(LMMFまたは推定プロアテローム発生流)につながります。例えば、時間平均壁せん断応力(TAWSS)は、中心に約0.3 Pa、5mm軌道半径13で150rpmで渦巻く6ウェルプレートの端に約0.7 Paである。この方法は、市販のプラスチック製品と軌道シェーカー自体のみを必要とします。
しかし、この方法(およびインビトロで流れを課す他の方法)には欠点があります:ECsはせん断に依存する方法で可溶性メディエーターおよび微粒子を放出し、この分泌物は、渦巻き媒体中での混合のために、それらが放出された以外のウェルの領域のECsに影響を与える可能性があります。これは、EC表現型に対するせん断応力の実際の影響を隠す可能性があります。例えば、Ghimらは、これは大きな粒子17の細胞間輸送に対する異なるせん断プロファイルの明らかに同一の影響を占めていると推測している。
ここでは、プルロニックF-127を用いて表面をパッシベーションし、他の場所での成長を防ぐためにフィブロネクチンコーティングを用いて、6ウェルプレートの特定の領域におけるヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)接着を促進する方法を説明する。この方法は、細胞の成長をセグメント化することによって、ECは1種類のせん断プロファイルしか経験せず、ウェル内の他のプロファイルに露出したECからの分泌物の影響を受けないので、上記の制限を解決する。
Protocol
Representative Results
Discussion
渦巻きウェル法は、中央の低マグニチュード多方向流(LMMF)とウェルの端に高マグニチュード単軸流(HMUF)の単一ウェルで複雑な流れプロファイルを生成することができます。しかし、可溶性メディケーターの剪断ストレス媒介分泌物は、渦巻き培地中に混合され、ウェル全体の細胞に影響を与え、細胞に対する特定のせん断応力プロファイルの真の効果をマスキングする可能性がある。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、英国心臓財団プロジェクト助成金(PDW)、全米医学研究評議会シンガポールTAAPおよびダイナモグラント(XW、NMRC/OFLCG/004/2018、NMRC/OFLCG/001/2017)、A*STAR大学院奨学金(KTP)、英国心臓財団研究優秀研究センター(MA)を認めています。
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
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