Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Summary

Cet article vise à présenter un protocole sur la façon de construire un microscope svFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) à variation ponctuelle pour mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes.

Abstract

Les processus biologiques dynamiques dans les cellules vivantes, y compris ceux associés à l’organisation de la membrane plasmique, se produisent à diverses échelles spatiales et temporelles, allant du nanomètre au micromètre et de la microseconde à la minute, respectivement. Un tel éventail de processus biologiques remet en question les approches de microscopie conventionnelles. Ici, nous détaillons la procédure de mise en œuvre des mesures de spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS) à l’aide d’un microscope à fluorescence classique qui a été personnalisé. Le protocole comprend un contrôle de performance spécifique de la configuration svFCS et les directives pour les mesures de diffusion moléculaire par svFCS sur la membrane plasmique des cellules vivantes dans des conditions physiologiques. De plus, nous fournissons une procédure pour perturber les nanodomaines du radeau de membrane plasmique par le traitement par le cholestérol oxydase et démontrons comment ces changements dans l’organisation latérale de la membrane plasmique pourraient être révélés par l’analyse svFCS. En conclusion, cette méthode basée sur la fluorescence peut fournir des détails sans précédent sur l’organisation latérale de la membrane plasmique avec la résolution spatiale et temporelle appropriée.

Introduction

La complexité de l’organisation des membranes plasmiques
La compréhension actuelle de l’organisation de la membrane cellulaire doit prendre en compte plusieurs aspects¹. Tout d’abord, une composition lipidique complexe varie non seulement entre les types de cellules, mais aussi au sein d’une seule cellule (organites membranaires/membrane plasmique). En outre, les protéines membranaires associées ou intrinsèques sont principalement organisées en complexes multimériques dynamiques, avec de grands domaines s’étendant à l’extérieur de la membrane, ce qui représente une surface significativement plus grande que celle des domaines transmembranaires seuls. De plus, les protéines associées à la membrane présentent des capacités spécifiques de liaison aux lipides ou d’interaction entre les lipides qui jouent un rôle dans la régulation de la fonction des protéines. Ceux-ci dépendent directement de la composition locale et de l’accessibilité des lipides².

Enfin, un niveau significatif d’asymétrie est observé entre deux feuillets membranaires en raison de la structure asymétrique intrinsèque des protéines membranaires et de la distribution des lipides. En effet, un équilibre métabolique lipidique entre synthèse et hydrolyse, combiné à une bascule lipidique entre les folioles, génère une telle distribution asymétrique. Comme tout transport à travers la bicouche est limité par l’énergie libre nécessaire pour déplacer le groupe de tête polaire à travers l’intérieur hydrophobe des membranes, il est généralement assisté par des transporteurs sélectifs. Pour chaque type de cellule, l’asymétrie a tendance à être fermement maintenue. Ensemble, ces facteurs contribuent à l’inhomogénéité latérale ou à la compartimentation de la membrane^{plasmique 3,4}.

Nous enrichissons cette représentation de la membrane plasmique en prenant en compte la diffusion moléculaire intrinsèque à l’intérieur et à travers la bicouche, qui contribue à l’hétérogénéité latérale dynamique sur une échelle de dixièmes à des centaines de nanomètres et de microsecondes à secondes. Par exemple, les nanodomaines membranaires dépendants des lipides – les radeaux lipidiques, définis comme du cholestérol, et les plates-formes de signalisation riches en sphingolipides – contribuent au compartimentation de la membrane ^{plasmique 5,6}. Cependant, la vision actuelle de l’organisation membranaire ne se limite pas aux seuls radeaux lipidiques. Les nanodomaines membranaires sont plus complexes et hétérogènes dans leur composition, leur origine et leur fonction. Néanmoins, leur présence au niveau de la membrane plasmique doit être étroitement coordonnée, et les interactions dynamiques entre les protéines et les lipides semblent être importantes dans la distribution spatiale et la modification chimique des nanodomaines membranaires 1,3,7,8.

Le principe svFCS et son application pour sonder l’organisation de la membrane plasmique
Bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans l’analyse des domaines membranaires, principalement grâce à des techniques biophysiques, les déterminants qui dictent l’organisation locale de la membrane plasmique doivent être affinés avec une résolution spatiale et temporelle appropriée. Les déterminants basés sur le suivi de molécules individuelles offrent une excellente précision spatiale et permettent la caractérisation de différents modes de mouvement 9,10,11,12, mais ont une résolution temporelle limitée avec de faibles fréquences d’images classiques et nécessitent plus d’efforts expérimentaux pour enregistrer un nombre important de trajectoires. Alternativement, le coefficient de diffusion des composants membranaires peut être évalué par récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)¹³ ou spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)¹⁴. Ce dernier a reçu plus d’attention, principalement en raison de sa sensibilité et de sa sélectivité élevées, de son volume de détection microscopique, de son faible caractère invasif et de sa large plage dynamique¹⁵.

La base conceptuelle de FCS a été introduite par Magde et ses collègues il y a environ 50 ans^16,17. Il est basé sur l’enregistrement de la fluctuation de l’émission de fluorescence avec une résolution temporelle élevée (de μs à s)¹⁸. Dans sa version moderne, les mesures dans les cellules vivantes sont effectuées par un petit volume d’excitation confocale (~ 0,3 femtolitres) positionné dans une région d’intérêt (par exemple, au niveau de la membrane plasmique); le signal de fluorescence généré par la diffusion de molécules fluorescentes entrant et sortant du volume d’observation est recueilli avec une très haute résolution temporelle (c’est-à-dire l’heure d’arrivée de chaque photon sur le détecteur). Ensuite, le signal est calculé pour générer la fonction d’autocorrélation (ACF), à partir de laquelle est extrait le temps moyen t d (temps de diffusion) pour lequel une molécule reste dans le volume focal, ainsi que le nombre moyen de particules (N), présentes dans le volume_{d’observation}, qui est inversement proportionnel à l’amplitude de l’ACF. Ce dernier paramètre pourrait être une information utile sur la concentration de la molécule dans le volume d’observation.

Depuis lors, un nombre croissant de modalités FCS ont été mises en œuvre grâce au développement rapide de l’instrumentation en biophotonique, permettant la description des phénomènes dynamiques se produisant dans les systèmes vivants. Néanmoins, une espèce moléculaire connaîtrait une distribution plus chevauchante des valeurs du coefficient de diffusion, ce qui se traduit généralement par une caractéristique de diffusion anormale, dans laquelle les molécules diffusent avec une relation non linéaire dans le temps¹⁹, et la difficulté d’identifier la signification biologique de cette sous-diffusion anormale. Dans le passé, cette difficulté a été quelque peu surmontée en enregistrant la diffusion moléculaire par FRAP à partir de zones de différentes tailles, plutôt que d’une seule zone, fournissant ainsi des informations spatiales supplémentaires. Cela a permis, par exemple, la conceptualisation de microdomaines^{membranaires 20,21,22}.

Une traduction de cette stratégie aux mesures FCS (c’est-à-dire la spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle (svFCS)) a été établie en faisant varier la taille du volume focal d’observation, ce qui a permis d’enregistrer la fluctuation de la fluorescence à différentes échelles spatiales²³. Ainsi, l’approche svFCS fournit des informations spatiales indirectes permettant l’identification et la détermination des modes de diffusion moléculaire et du type de partitionnement membranaire (domaines isolés versus contigus²⁴) des molécules étudiées. En traçant le temps_de diffusion t d en fonction des différentes échelles spatiales définies par la valeur de la taille (ω), qui correspond à la taille du rayon du faisceau de détection dans ce cas^23,25, on peut caractériser la loi de diffusion d’une molécule donnée dans un état physiologique donné. Le svFCS est donc un analogue parfait au suivi d’une seule particule dans le domaine temporel²⁶. Sous la contrainte de diffusion brownienne, il faut s’attendre à une relation strictement linéaire entre le temps de diffusion t_d et la taille ω (Figure 1)^23,25. L’origine de la déviation de la loi de diffusion par rapport à ce schéma peut être attribuée à des raisons non exclusives, telles que le maillage du cytosquelette, l’encombrement moléculaire, le partitionnement dynamique dans les nanodomaines, ou toute combinaison de ces effets et d’autres (Figure 1), et doit être testée expérimentalement²⁵.

Ici, nous fournissons tous les points de contrôle nécessaires pour l’utilisation quotidienne d’un système optique svFCS sur mesure construit à partir de zéro, qui complète nos examens de protocole précédents^27,28 sur cette approche expérimentale. En outre, comme preuve de concept, nous donnons des directives concernant l’étalonnage de la configuration, la préparation des cellules, l’acquisition de données et l’analyse pour l’établissement de la loi de diffusion svFCS (DL) pour Thy1-GFP, une protéine ancrée dans le glycosylphosphatidylinositol de la membrane plasmique, qui est connue pour être localisée dans les nanodomaines de radeau lipidique²⁹. Enfin, nous démontrons comment la déstabilisation partielle des nanodomaines du radeau lipidique par le traitement à la cholestérol oxydase affecte les propriétés de diffusion de Thy1-GFP. En outre, une description détaillée de la construction d’une configuration svFCS à partir de zéro est fournie dans Matériel supplémentaire.

Protocol

1. Définition des spécifications pour l’assemblage d’une configuration svFCS sur mesure REMARQUE: La simplicité de la configuration svFCS proposée permet une installation, une utilisation et une maintenance faciles à faible coût tout en assurant l’efficacité de la récupération des photons. Pour plus de détails, voir Documents supplémentaires. Salle expérimentale et sécurité Installez le système dans une pièce stabilisée à environ 21 °C. Évitez le flux d’air direct sur la table optique passive (ou active) et suivez les règles de sécurité laser pour l’alignement optique. Matériel et logicielsREMARQUE : Le matériel supplémentaire détaille les étapes d’installation illustrées à la figure 2. Écrivez le logiciel d’acquisition et de contrôle principal dans LabVIEW à l’aide d’une architecture de machine d’état et de structure d’événements où une carte d’acquisition multifonction pilote la plupart des contrôleurs.REMARQUE: Le corrélateur, le laser et le capteur de puissance sont contrôlés ou surveillés par leur propre logiciel. Adaptez les procédures d’installation matérielle et logicielle en fonction du matériel utilisé. Configuration optiqueREMARQUE : La figure 3 illustre les modules de banc optique utilisés dans les sections suivantes pour contrôler la qualité des alignements optiques. Toutes les spécifications des éléments optiques sont répertoriées dans le tableau des matériaux. La procédure de construction de la configuration est largement détaillée dans le matériel supplémentaire. Ce système comprend un laser à ondes continues, un microscope inversé motorisé équipé d’un objectif d’eau à immersion, un détecteur de photodiode d’avalanche couplé à un seul module de comptage de photons et un corrélateur matériel. Une chambre d’incubation de microscope avec des réchauffeurs sans vibration a été spécialement conçue pour contrôler la température pour les expériences sur les cellules vivantes. Par convention, l’axe XY correspond au plan perpendiculaire du chemin optique et l’axe Z correspond au chemin optique. 2. Point de contrôle quotidien avant d’exécuter l’expérience Contrôlez le chemin d’excitation (Figure 3, & ). Ouvrez tous les diaphragmes de l’iris. Mesurez la puissance du laser avec le capteur de puissance, en gardant le premier iris complètement ouvert. Tournez la plaque demi-onde (HWP) pour trouver la puissance maximale. Vérifiez l’alignement à l’aide des iris si la puissance laser est inférieure à la normale et déplacez L1 et M1 alternativement, si nécessaire. Notez la valeur de puissance dans le carnet de laboratoire d’expérience. Contrôlez le chemin de détection (Figure 3, & ). Placer l’eau, un couvercle et une gouttelette d’une solution de rhodamine 6G (Rh6G) de 2 nM sur l’objectif. Si le signal de fluorescence (nombre de comptage sur l’APD, enregistré avec le logiciel LabVIEW) est plus faible que d’habitude, refaites la solution Rh6G, vérifiez le positionnement et le numéro du couvercle sur l’objectif ou éliminez les bulles, le cas échéant. Si le signal de fluorescence est encore plus faible que d’habitude, placez le capteur de puissance à l’intérieur du chemin optique pour bloquer le faisceau. Désactivez l’APD (ci-après, APD fait référence à l’APD et au module de comptage de photons uniques). Retirez l’échantillon. Nettoyez et remplacez l’objectif par une cible réfléchissante. Vérifiez le faisceau laser sur la cible réfléchissante en retirant le capteur de puissance du trajet de la lumière. Assurez-vous que le faisceau de la cible est centré et que la réflexion arrière atteint le premier iris de la ligne (Figure 3). Sinon, ajustez le positionnement central avec M2 ou la réflexion arrière avec le miroir dichroïque. Si le couplage du microscope est correct, repoussez la lentille de l’objectif, ajoutez une goutte d’eau, un couvercle et une gouttelette d’une solution Rh6G plus concentrée (c’est-à-dire 200 nM) et réglez une puissance laser inférieure à celle des mesures classiques (quelques μW). Allumez l’APD et optimisez l’alignement de l’APD et du sténopé, alternativement, avec leurs vis de réglage XYZ respectives tout en surveillant le signal d’intensité (logiciel LabVIEW). Changez le couvercle et ajoutez une concentration plus faible de Rh6G (2 nM). Déplacez le sténopé le long de l’axe Z pour trouver une position où le rapport de luminosité moléculaire augmente et où la taille est minimale. Fermez l’iris jusqu’à ce que le signal tombe : la taille du faisceau laser atteint la taille de l’ouverture arrière de l’objectif (c’est-à-dire le tour de taille minimal, voir Matériel supplémentaire). Lancez le logiciel de corrélation et enregistrez les données (voir la section 7 pour l’enregistrement des données). Vérifiez l’ACF, qui doit afficher une faible quantité de bruit, donner un petit tour de taille et un taux de comptage élevé par molécule et par seconde (voir la section 7 pour l’analyse des données et l’évaluation du tour de taille). 3. Considérations générales pour l’enregistrement et l’analyse des données svFCS Enregistrer et analyser les données de fluorescence selon ce schéma général (voir sections 7, 8 et 9): (1) enregistrement de fluorescence et génération ACF (logiciel de corrélation), (2) rejet inattendu des données, moyenne des données conservées, ajustement avec le modèle approprié (avec le logiciel Igor Pro fait maison), (3) diagramme de loi de diffusion (logiciel MATLAB maison 1) et (4) comparaison facultative de la loi de diffusion (logiciel MATLAB maison 2). Les différents logiciels sont disponibles sur demande.REMARQUE : Le corrélateur matériel a un temps d’échantillonnage minimum de 12,5 ns (c.-à-d. une fréquence d’échantillonnage de 80 MHz). Il fournit une résolution temporelle inférieure d’au moins 1 000 au temps de résidence typique de la diffusion libre d’une petite molécule en solution et de 10à 6 fois inférieure au temps de diffusion des protéines membranaires dans un volume d’observation confocale. 4. Culture cellulaire et transfection Ensemencez les cellules Cos7 dans du verre de couverture chambré à 8 puits avec un fond en verre borosilicate #1.0 à une densité de 10 000 cellules/ puits en utilisant le milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco complété par 5% de sérum bovin fœtal, de pénicilline (100 U / mL), de streptomycine (100 U / mL) et de L-glutamine (1 mM). Cultiver les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 pendant 24 h. Retirer le milieu, ajouter 300 μL du milieu de culture complet frais par puits et préincuber les cellules pendant 30 min à 37 °C. Diluer 0,5 μg de l’ADN plasmidique codant pour la protéine Thy-1 fusionnée avec eGFP25 dans 50 μL de DMEM sans sérum. Vortex brièvement à mélanger. Diluer 1,5 μL du réactif de transfection de l’ADN dans 50 μL de DMEM sans sérum et bien mélanger la solution. Ajouter le réactif de transfection dilué directement dans la solution d’ADN préparée et mélanger les composés immédiatement. Incuber le mélange préparé pendant 10 à 15 min à température ambiante. Ajouter 10 μL des complexes combinés ADN/réactif de transfection goutte à goutte sur le milieu dans chaque puits, et homogénéiser en faisant tourbillonner doucement la plaque. Incuber les cellules à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 h. Après l’incubation, remplacer le milieu contenant des complexes de réactifs ADN/transfection par 400 μL de DMEM complet frais et cultiver les cellules pendant 16 h avant l’expérience svFCS. 5. Préparation des cellules pour les mesures svFCS Retirez le milieu de culture. Lavez doucement les cellules deux à trois fois avec la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank sans sérum contenant du Ca2+ et du Mg2+ complété par 10 mM (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES). Maintenir les cellules dans le tampon HBSS/HEPES pendant toutes les acquisitions de svFCS. 6. Traitement pharmacologique Retirer le milieu de culture et laver les cellules deux à trois fois avec hbSS sans sérum complété par 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES). Incuber les cellules avec 1 U/mL de solution de cholestérol oxydase (COase) dans un tampon HBSS/HEPES pendant 1 h à 37 °C. Retirez la solution et maintenez les cellules en présence de 0,1 U/mL de COase dans le tampon HBSS/HEPES pendant les mesures svFCS. 7. Calibrage de la taille du spot Préchauffer la chambre du microscope à 37 °C. Préparer une solution étalon de 2 nM de Rh6G par dilution en série. Déposer 200 μL de solution de 2 nM Rh6G sur un couvercle en verre placé sur l’objectif d’immersion dans l’eau. Démarrez tout le matériel et les logiciels. Mesurer et ajuster la puissance du faisceau laser de 488 nm à 300 μW. En fonction de la luminosité et de la photo-stabilité de la sonde fluorescente utilisée, adapter cette puissance en fonction de (1) l’intensité de fluorescence (sur le logiciel LabVIEW), qui doit être stable, (2) la forme ACF (sur le logiciel de corrélation), qui doit avoir une forme constante dans le temps, et (3) les paramètres d’ajustement donnant un petit tour de taille et un taux de comptage élevé par molécule (photons par molécule par seconde, généralement quelques dizaines à des centaines de photons par molécule et par seconde).REMARQUE : L’amplitude de l’ACF (appelée G(0)) est inversement proportionnelle au nombre de la molécule (c.-à-d. la concentration de la sonde fluorescente). Pour l’étalonnage du tour de taille, il s’agit d’un bon paramètre candidat au contrôle de la qualité. Par conséquent, G(0) devrait être similaire pour la même concentration d’un jour à l’autre car il relie le tour de taille et la concentration. Pour les mesures cellulaires, comme FCS est plus précis pour une faible concentration, G(0) doit être élevé pour l’extraction appropriée du réglage des paramètres. Réglez la voie du microscope d’éclairage/détection svFCS avec le logiciel LabVIEW. Activez l’APD. Fermez l’iris jusqu’à ce que le signal tombe pour obtenir le tour de taille minimal, ou fermez-le pour un tour de taille plus grand. Enregistrez plusieurs ACF de durée sélectionnée (à savoir une exécution) pour améliorer la reproductibilité statistique, généralement 10 exécutions d’une durée de 20 s chacune avec le logiciel de corrélation. Désactivez l’APD. Utilisez le logiciel Igor Pro pour vérifier et éliminer les courses avec de fortes fluctuations dues aux agrégats moléculaires. Effectuez cette étape manuellement : elle doit être indépendante de l’utilisateur une fois que les utilisateurs ont été formés. Ajuster la moyenne des ACF retenus avec un modèle de diffusion 3D. Extrayez des paramètres d’ajustement le temps de diffusion moyen et enregistrez-le dans un fichier « .txt » (le format de fichier est dicté par le logiciel Igor Pro). Vérifiez le taux de comptage par molécule et par seconde (un bon indicateur de performance) en divisant l’intensité moyenne (extraite de la trace de fluorescence) par le nombre de molécules (extraites de l’ACF).REMARQUE: Assurez-vous que cette valeur est élevée et stable d’un jour à l’autre pour les mêmes paramètres d’acquisition. Connaissant le coefficient de diffusion de Rh6G en solution aqueuse à 37 °C (D) et (voir 7.13), calculer le tour de taille expérimental ω selon : . Appliquez la procédure pour chaque modification du tour de taille nécessaire pour tracer la loi de diffusion FCS et avant toute nouvelle série expérimentale d’acquisition de données svFCS. 8. Acquisitions de données svFCS sur les cellules Mesurez et ajustez la puissance du faisceau de 488 nm entre 2 et 4 μW. En fonction de la luminosité et de la photostabilité de la sonde fluorescente utilisée, adaptez cette puissance pour permettre un taux de comptage élevé par molécule (généralement plusieurs milliers de photons par molécule et par seconde), tout en maintenant le photoblanchiment bas (c’est-à-dire une trace d’intensité stable sur le logiciel LabVIEW). Équilibrer les échantillons pendant 10 min à 37 °C avant de commencer les mesures. Réglez le microscope d’éclairage à épifluorescence avec le logiciel LabVIEW. Choisissez une cellule avec un emplacement de sonde fluorescent approprié et une (faible) intensité du signal de fluorescence.REMARQUE: Plus la fluorescence est faible, meilleures sont les mesures FCS (voir étape 8.1). Réglez la voie du microscope d’éclairage/détection svFCS avec le logiciel LabVIEW. Activez l’APD. Effectuez un xy-scan de la cellule sélectionnée avec le logiciel LabVIEW. Effectuez un z-scan et localisez la tache confocale à l’intensité de fluorescence maximale en choisissant la membrane plasmique en haut et en commençant l’acquisition des données. Pour maximiser la séparation entre les deux membranes, effectuez de préférence le scan dans la zone nucléaire de la cellule. Enregistrez une série de 20 runs d’une durée de 5 s, chacun avec le logiciel de corrélation.REMARQUE: Assurez-vous que la durée de chaque exécution est suffisamment longue pour obtenir des ACF avec un bruit réduit. Les acquisitions longues sont sujettes au photoblanchiment ou à des variations importantes inattendues (p. ex., agrégats). Adaptez le nombre d’exécutions, leur durée et le nombre de séries aux échantillons, mais assurez-vous qu’ils restent constants dans la même masse d’expériences pour la reproductibilité. Désactivez l’APD. Éliminez les exécutions inattendues avec le logiciel Igor Pro. Adaptez l’ACF moyen à un modèle de diffusion 2D à 2 espèces. Adapter ce modèle au type de comportement de diffusion de la molécule cible. Enregistrez les paramètres d’ajustement dans le fichier précédent (voir étape 7.13). Effectuez 10 à 15 séries d’enregistrements sur au moins 10 cellules différentes et reproduisez les étapes 8.3 à 8.13. Vérifiez que la lime unique obtenue contient les informations sur le tour de taille et les paramètres d’ajustement des 10 à 15 enregistrements. Pour établir une loi de diffusion unique, analysez au moins quatre tour de taille variant entre 200 et 400 nm. Cette plage est définie par la limite optique de diffraction, mais dépend de l’objectif (ouverture numérique) et du laser (longueur d’onde).REMARQUE: Comme l’étalonnage du tour de taille n’est pas absolu et présente un certain degré d’incertitude, un logiciel MATLABdédié 28 prenant en compte les erreurs x et y (à savoir ω2 et td) a été conçu pour s’adapter à la loi de diffusion. Démarrez le logiciel MATLAB 1 et sélectionnez un dossier contenant tous les fichiers « .txt » correspondant à au moins quatre expériences de tour de taille. Plot < pasd> versus <ω2>, à savoir la loi de diffusion. Deux paramètres majeurs peuvent être extraits : l’interception de l’axe des y (t0) et le coefficient de diffusion effectif (Deff, inversement proportionnel à la pente). 9. Lois de diffusion de différentes conditions expérimentales de comparaison REMARQUE: Si nécessaire, reproduire les sections 7 et 8 pour différentes conditions expérimentales. Un logiciel dédié (logiciel MATLAB 2) a été développé pour déterminer si ces lois de diffusion sont similaires ou non selon les valeurs t0 et Deff 28. Il teste deux hypothèses : les deux valeurs sont différentes, ou les deux valeurs ne sont pas différentes à un seuil fixé au-dessus d’une probabilité de fausse alerte (PFA). Une valeur arbitraire de PFA de 5% (T = 3,8) est considérée comme la limite supérieure de signification entre deux paramètres (t0 ou Deff), indiquant qu’il n’y a que 5% de chances que les deux valeurs soient identiques. Créez un fichier « .xls » contenant les valeurs de loi de diffusion caractéristiques de chaque condition à comparer (c’est-à-dire un fichier contenant l’erreur t0, t0, L’erreur D eff et Deff pour les conditions non traitées (NT) et traitées (COase) sous forme de tableau). Démarrez le logiciel MATLAB 2. Sélectionnez le fichier « .xls ». Analysez le diagramme 2D à code couleur généré, où les tests statistiques t0 et Deff doivent être tracés sur les axes x et y, respectivement (Figure 4). Plus T est élevé, plus la différence entre les valeurs comparées est grande. 10. Mesures de la concentration de cholestérol Traitement cellulaire et lyse Ensemencez les cellules Cos7 en triplel dans des plaques de 6 puits à 4 × 105 cellules/puits et incubez dans 2 mL de DMEM complet à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit pour permettre aux cellules de se fixer à la plaque. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 1 mL de tampon HBSS/HEPES contenant (ou non, pour les contrôles) 1 U/mL de Coase, et incuber pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2. Remplacer le milieu par 1 mL de HBSS/HEPES contenant 0,1 U/mL de coase et incuber pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2. Retirez la solution et récoltez les cellules. Lavez les cellules trois fois avec du PBS et centrifugez à 400 × g pendant 5 min à température ambiante. Lyser les cellules avec un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM d’acide tétraacétique éthylènediamine, 2% de glycérol, de protéase et de cocktail d’inhibiteurs de phosphatase) pendant 30 min sur glace. Centrifuger les lysats à 10000 × g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Quantifier la concentration totale en protéines pour chaque échantillon en modifiant le dosage des protéines de Bradford à l’aide de la solution de travail conformément aux recommandations du fabricant. Mesure de la concentration de cholestérol Pour déterminer le taux de cholestérol cellulaire total de façon enzymatique, utilisez la trousse appropriée (p. ex., trousse de dosage du cholestérol rouge Amplex) conformément aux recommandations du fabricant. Pour chaque réaction, mélanger l’échantillon contenant 5 μg de protéines avec la solution de travail réactif Amplex Red/peroxydase de raifort/cholestérol oxydase/cholestérol estérase, et incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité. Mesurez la fluorescence à l’aide d’une excitation de 520 nm et détectez l’émission à 560-590 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Soustrayez le fond de la valeur finale et déterminez la concentration de cholestérol à l’aide d’une courbe standard. Calculer la teneur finale en cholestérol en ng de cholestérol par μg de protéines.

Representative Results

Nous avons généré un DL pour Thy1-GFP exprimé en cellules Cos-7 (Figure 4, carrés noirs). La loi de diffusion a une valeur t0 positive (19,47 ms ± 2 ms), indiquant que Thy1-GFP est confiné dans des structures de nanodomaine de la membrane plasmique. Le traitement par cholestérol oxydase des cellules exprimant Thy1-GFP a entraîné le déplacement de la valeur DL t0 à 7,36 ± 1,34 ms (Figure 4, carrés gris). Cette observation confirme que la nature du confinement de Thy1-GFP dépend de la teneur en cholestérol et est associée à des nanodomaines de radeau lipidique. Ces deux lois de diffusion se révèlent différentes selon le test statistique décrit ci-dessus (voir étape 9.1.3) en termes de valeurs t0 et Deff . De plus, nous avons évalué la concentration de cholestérol cellulaire total dans les cellules Cos-7 non traitées par rapport aux cellules traitées par COase. Une diminution faible, mais significative, de la teneur en cholestérol total est observée lors du traitement par COase (Figure 5). Comme cette enzyme n’agit que sur le pool de cholestérol accessible à la feuillet externe de la membrane plasmique, nous supposons que la diminution observée du cholestérol n’est associée qu’à la membrane plasmique et entraîne la déstabilisation des nanodomaines du radeau lipidique. Figure 1 : Lois de diffusion de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) simulées établies par FCS à variation ponctuelle pour différentes formes d’organisation membranaire. (Panneaux supérieurs) Représentation schématique de l’organisation membranaire ( A) diffusion libre, (B) barrières de maillage et (C) confinements piège/domaine — avec la trajectoire tracée pour une seule molécule (rouge). Les cercles bleus désignent l’intersection de la membrane et du faisceau laser de la taille ω. (Panneaux inférieurs) Lois de diffusion FCS représentées en traçant le temps de diffusion td en fonction du rayon carré ω2. La projection de la loi de diffusion (ligne pointillée verte) intercepte l’axe temporel à (A) l’origine (t0 = 0) dans le cas de la libre diffusion; (B) dans l’axe négatif (t0 < 0) lorsqu’il y a des barrières de maillage, ou (C) dans l’axe positif (t0 > 0) lorsqu’il y a des pièges et des domaines (radeaux lipidiques). D est le coefficient de diffusion latérale pour le mouvement brownien; Deff, le coefficient de diffusion effectif; Dmicro, le coefficient de diffusion microscopique à l’intérieur des pièges maillés; Din, le coefficient de diffusion à l’intérieur des domaines; Dout, le coefficient de diffusion en dehors des domaines; L, la taille du côté d’un domaine carré; et rD, le rayon d’un domaine circulaire. Ce chiffre a été modifié à partir de He et Marguet6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Vue schématique du contrôle matériel svFCS. L’ordinateur contrôle tous les appareils via différents protocoles de communication: série (microscope, obturateur externe), USB (étage piézoélectrique XYZ, corrélateur) et PCI (carte d’acquisition). DAQ : carte d’acquisition de données, APD : photodiode d’avalanche, SPCM : module de comptage monophotonique, DO : sortie numérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Vue schématique des chemins optiques d’excitation et d’émission de la configuration svFCS. La configuration svFCS contient quatre modules: (1) la sortie d’un laser à fibre de 488 nm est collimée, (2) une combinaison d’une plaque demi-onde et d’un séparateur de faisceau polarisant définit la puissance optique, (3) le faisceau laser focalisé sur l’échantillon après avoir voyagé à travers un microscope motorisé sans lentille tubulaire, et (4) la fluorescence est détectée par un chemin de détection confocal sur une photodiode d’avalanche couplée à un seul module de comptage de photons, qui délivre un signal à un corrélateur matériel. La simplicité confère au système sa sensibilité, sa robustesse et sa facilité d’utilisation (largement commenté dans Supplementary material). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Les lois de diffusion svFCS générées par l’analyse de diffusion de Thy1-GFP exprimées en Cos-7. lois de diffusion svFCS des cellules Cos-7 sans traitement (NT, carrés noirs) et après traitement par cholestérol oxydase (COase, cercles gris). L’encart dans le graphique représente le test statistique d’une différence significative entre les deux lois de diffusion svFCS présentées (selon Mailfert et al.28). La valeur d’essai (T) doit être supérieure au seuil fixé à 3,8 lorsque les deux lois de diffusion sont différentes. Plus il est élevé, plus la différence entre les lois de diffusion est grande. La valeur de T est codée par couleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Comparaison de la teneur en cholestérol total dans les cellules Cos-7. Les cellules Cos-7 ont été soit non traitées (NT), soit traitées avec 1 U/mL de cholestérol oxydase (COase) pendant 1 h. Les données représentent un exemple d’expérience en trois exemplaires. Un test t à deux queues et non apparié a été utilisé pour évaluer la différence statistique (α = 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Tableau des matières: Liste des éléments optiques requis pour la configuration svFCS. Matériel supplémentaire : Ce document décrit la création d’une configuration svFCS à partir de zéro. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, nous avons décrit la mise en œuvre du module svFCS sur un microscope fluorescent standard, une approche expérimentale puissante pour déchiffrer la dynamique de l’organisation de la membrane plasmique dans les cellules vivantes grâce à l’analyse de la loi de diffusion FCS. Conceptuellement, le svFCS repose sur un principe simple : des mesures de corrélation de fluorescence dans le domaine temporel tout en faisant varier la taille de la zone d’éclairage²³. Cette stratégie a joué un rôle déterminant dans la déduction d’informations nanoscopiques à partir de mesures microscopiques, ce qui aide à déchiffrer les principaux éléments physico-chimiques contribuant à l’organisation de la membrane plasmique à l’état d’équilibre²⁵ et aux processus physiologiques ^30,31,32,33. Dans l’ensemble, ces analyses svFCS démontrent sans ambiguïté l’existence de nanodomaines lipidiques dans divers types de cellules et leur implication directe dans le réglage de différents événements de signalisation.

Dans ce cadre, certains aspects optiques doivent être pris en compte lors de la construction de la configuration svFCS afin d’optimiser le budget de photons et de minimiser les aberrations optiques. Ainsi, nous vous recommandons d’utiliser un microscope à partir duquel la lentille tubulaire peut être retirée lorsque la mesure svFCS est effectuée. De plus, un seul iris joue un rôle clé dans la configuration svFCS : il modifie la taille du faisceau à l’ouverture arrière de l’objectif, faisant ainsi varier directement le tour de taille effectif (c’est-à-dire le volume d’excitation effectif). Le diamètre de la poutre doit s’adapter à la pupille arrière de l’objectif pour obtenir le plus petit tour de taille³⁴. Cette option, qui permet d’ajuster le tour de taille, assure l’optimisation du budget photon et est facile à mettre en œuvre. Enfin, un nombre minimal de pièces optiques sont utilisées le long du trajet de la lumière; moins le système est complexe, moins il y a de photons perdus. Toutes ces options améliorent considérablement la robustesse des expériences svFCS.

En ce qui concerne le protocole lui-même, quelques étapes critiques doivent être prises en compte. Le plus important est un alignement approprié des chemins optiques qui est crucial pour des mesures svFCS réussies (protocole, section 2). Ceci est facile à vérifier en analysant le signal de fluorescence d’une solution Rh6G de 2 nM, qui devrait être d’environ 200 kHz sous un éclairage laser de 300 μW. Tous les iris doivent être ouverts et les ACF doivent avoir une amplitude importante (généralement G0 ~ 1,5-2,0). Un autre point critique concerne les cellules et leur préparation pour l’analyse svFCS (protocole, sections 4-8). Leur densité doit être adaptée afin que les cellules isolées à observer soient disponibles pour analyse. Les cellules non adhérentes doivent être immobilisées sur un verre de couverture chambré en utilisant une solution de poly-L-lysine. Le signal de fluorescence de l’étiquetage des cellules ne doit pas être trop fort, sinon il en résultera des ACF très plats difficiles à ajuster, et les paramètres d’ajustement sont chargés d’une erreur importante. De plus, le marquage non homogène et les agrégats de fluorescence dans les cellules rendent les mesures svFCS extrêmement difficiles à interpréter. Enfin, le traitement par cholestérol oxydase affecte la viabilité cellulaire et l’analyse svFCS ne doit pas dépasser une heure après le traitement. Il est également préférable d’enregistrer les fluctuations de fluorescence de la membrane plasmique supérieure car elle n’est pas attachée au support et il n’y a aucun risque d’entrave à la diffusion des molécules en raison des interactions physiques avec le support.

Il y a eu suffisamment de progrès dans la technique svFCS pour son utilisation dans différentes approches en raison de la diversité des modalités d’ajustement du volume de détection, ce qui permet d’étudier divers processus biologiques dans les cellules vivantes. Une alternative au réglage de la taille du volume d’excitation consiste à utiliser un expanseur de faisceau variable³⁵. Il est également possible de moduler simplement la taille de la zone d’éclairage en enregistrant le signal fluorescent de l’interception de la membrane plasmique le long de la direction z³⁶. Cela peut être fait sur un microscope confocal standard pour lequel un cadre théorique a été développé pour dériver la loi de diffusion^37,38.

Bien que la méthode svFCS offre une résolution spatio-temporelle, nécessaire à la caractérisation de l’organisation latérale inhomogène de la membrane plasmique, les modes géométriques de confinement ne s’excluent pas mutuellement. Un écart de t₀ dans un sens ou dans l’autre révèle exclusivement un mode dominant de confinement²⁵. De plus, une autre limitation importante de la méthode svFCS actuelle résulte de la limite de diffraction optique classique (~200 nm). Ceci est incontestablement plus grand que les domaines confinant les molécules dans la membrane plasmique cellulaire. Par conséquent, l’analyse du confinement est déduite de la valeur t₀ , extrapolée à partir de la loi de diffusion.

Cet inconvénient a été surmonté par la mise en œuvre de méthodes alternatives. Initialement, l’utilisation de films métalliques percés de nanoapertures offrait la possibilité d’éclairer une très petite surface membranaire (c’est-à-dire en dessous de la limite de diffraction optique des ouvertures nanométriques uniques de rayons variant entre 75 et 250 nm)³⁹. Le régime de transition prédit à partir de la loi de diffusion théorique pour l’organisation de domaines isolés a ainsi été rapporté, et il a permis d’affiner la taille caractéristique des hétérogénéités de la membrane nanométrique et une estimation quantitative de la surface occupée par les nanodomaines dépendants des lipides³⁹. Alternativement, l’éclairage nanométrique a également été développé en utilisant la microscopie optique à balayage en champ proche⁴⁰ ou les nanoantennes optiques planaires⁴¹. Plus récemment, la combinaison de l’épuisement stimulé des émissions (STED) et du FCS a fourni un outil puissant et sensible pour documenter la loi de diffusion avec une très haute résolution spatiale. Ce STED-FCS donne accès à des caractéristiques de diffusion moléculaire à l’échelle nanométrique se produisant dans un court laps de temps, permettant l’étude de l’organisation dynamique des sondes lipidiques au niveau de la membrane ^{plasmique 42,43}. Cependant, la suppression incomplète de la fluorescence dans le processus STED remet en question l’analyse des courbes d’auto-corrélation dans FCS.

Un nouveau modèle d’ajustement a été développé pour surmonter cette difficulté, en améliorant la précision des temps de diffusion et des mesures moyennes du nombre de molécules⁴⁴. Enfin, pour une diffusion moléculaire lente au niveau de la membrane plasmique, le principe svFCS peut être appliqué aux données enregistrées par spectroscopie de corrélation d’images⁴⁵. Récemment, il a été démontré que la combinaison de la microscopie à force atomique (AFM) avec l’imagerie par réflexion interne totale FCS (ITIR-FCS) contribue à affiner la nature du mécanisme entravant la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique, en particulier près de la configuration de la membrane seuil de percolation en raison d’une densité élevée de nanodomaines⁴⁶.

En conclusion, l’établissement de la loi de diffusion par svFCS a fourni les preuves expérimentales permettant de déduire l’hétérogénéité locale créée par les lipides collectifs dynamiques et les associations de protéines membranaires. Comme l’ont déclaré Wohland et ses collègues⁴⁶, « l’analyse de la loi de diffusion FCS reste un outil précieux pour déduire des caractéristiques structurelles et organisationnelles inférieures à la limite de résolution à partir d’informations dynamiques ». Néanmoins, nous devons développer de nouveaux modèles pour affiner l’interprétation de la loi de diffusion qui devrait permettre une meilleure compréhension de la dynamique des événements moléculaires se produisant au niveau de la membrane plasmique.

Materials

Aligment tool	Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings	Thorlabs	SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)	Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m	RS Components	742-4315
	Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2	RS Components	885-8172
	Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz	RS Components	546-4948
	Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V	RS Components	768-5500
	Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C	RS Components	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter	RS Components	792-4079
Fluorescence filtering	535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm	AHF filter	F47-539
	Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm	AHF filter	F43-088
	496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25	AHF filter	F37-496
Hardware correlator	80 MHz Digital Correlator	Correlator.com	Flex02-12D
Laser	LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
Laser safety	High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll	Thorlabs	T743-2.0
	Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets	Thorlabs	MC-5
	Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission	Thorlabs	LG3B
Microscope	Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters	Carl Zeiss
	C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR	Carl Zeiss	421767-9971-711
	Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	Middle ring W0.8 – W0.8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
Optical path	D25.4mm Mirror, Protected Silver	Thorlabs	PF10-03-P01
	D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat	Thorlabs	AC254-060-A
	D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat	Thorlabs	AC254-035-A
	25 µm mounted pinhole	Thorlabs	P25S I
	25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm	Thorlabs	PBS201
	Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount	Thorlabs	KM100B/M
	Adjustable Prism Clamp	Thorlabs	PM3/M
	Beam block – active area 19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M
	Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture	Thorlabs	ID25/M
	Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount	Thorlabs	KM100CL
	1" Optic Holder, M4 Tap	Thorlabs	MFF101/M
	1" Stackable Lens Tube	Thorlabs	SM1L03
	Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½	Thorlabs	SM1L05
	Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2"	Thorlabs	SM1L20
	Small Optical Rails 600mm, metric	Thorlabs	RLA600/M
	Small Optical Rails 75mm, metric	Thorlabs	RLA075/M
	Small Optical Rails 150mm, metric	Thorlabs	RLA150/M
	Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1"	Thorlabs	RC1
	Rail Carrier, Perpendicular Dovetail	Thorlabs	RC3
	High Precision Translating Lens Mount for 1 inch	Thorlabs	LM1XY/M
	½ " (12mm) Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12/M
	Rail Clamps	Thorlabs	CL6
	Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)	Thorlabs	PT3/M
	Black Rubberized Fabric	Thorlabs	BK5
	Ball Driver kit/ 6 tools	Thorlabs	BD-KIT/M
	Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads	Thorlabs	AP6M4M
	Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack	Thorlabs	BA1S/M-P5
	Lens Mount for 25.4mm optic	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APC Adapter	Thorlabs	SM1FCA
	Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics	Thorlabs	KM100
	Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW	Thorlabs	S120C
	12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack	Thorlabs	PH50/M-P5
	Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm	Thorlabs	PH20/M
	12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack	Thorlabs	TR50/M-P5
	12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack	Thorlabs	TR75/M-P5
	USB Power and Energy Meter Interface	Thorlabs	PM100USB
	12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole	Thorlabs	TR30/M
	12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole	Thorlabs	TR20/M
	750 mm long Structural Rail (detection box)	Thorlabs	XE25L750/M
	350 mm long Structural Rail (detection box)	Thorlabs	XE25L350/M
	Quick Corner Cube for 25 mm Rails	Thorlabs	XE25W3
	Right-Angle Bracket for 25 mm Rails	Thorlabs	XE25A90
	Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets	Thorlabs	TB5
	Hinge for 25 mm Rail Enclosures	Thorlabs	XE25H
	Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures	Thorlabs	XE25LS
	M4 Cap Screw Kit	Thorlabs	HW-KIT1/M
	M6 Cap Screw Kit and Hardware kit	Thorlabs	HW-KIT2/M
	Table Clamp, L-Shape, 5 Pack	Thorlabs	CL5-P5
	SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm)	Thorlabs	SM1D12D
	Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD
	Honeycomb Optical Table Top, Standa	Standa	1HB10-15-12
	Optical Table support, Standa	Standa	1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning	Precision XYZ Nanopositioning	Physik Instrumente	PI P527-3.CD
	Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,	Physik Instrumente	PI E727-3.CD
Temperature chamber	Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK	Digital Pixel
	Dual Channel Microprocessor Temperature Controller	Digital Pixel	DP_MTC_2000_DUO
	Two Vibration Free Heater Modules	Digital Pixel	DP_150_VF
	PT100 Temperature Sensor	Digital Pixel	DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection	Cos7 cells	ATCC®	CRL-1651™
	8- well Lab-Tek chambers	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
	Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
	PBS buffer	Thermo Fisher Scientific	14190144
	PenStrep	Thermo Fisher Scientific	15140122
	PolyJet Transfection Reagent	SignaGen Laboratories	SL100688
Cholesterol content measurement	Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A12216
	Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	87786
	Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78420
	ROTI Nanoquant Working Solution	Roth	K880
	GloMax Discover Microplate Reader	Promega	GM3000
svFCS measurements	HBSS buffer	Thermo Fisher Scientific	14025092
	Hepes buffer	Thermo Fisher Scientific	15630080
	Cholesterol oxidase	Sigma-Aldrich	C8868
	Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	83697-1G