Denne artikkelen tar sikte på å presentere en protokoll om hvordan man bygger et flekkvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS) mikroskop for å måle molekylær diffusjon ved plasmamembranen til levende celler.
Dynamiske biologiske prosesser i levende celler, inkludert de som er forbundet med plasmamembranorganisasjon, forekommer på forskjellige romlige og tidsmessige skalaer, alt fra henholdsvis nanometer til mikrometer og mikrosekunder til minutter. Et så bredt spekter av biologiske prosesser utfordrer konvensjonelle mikroskopitilnærminger. Her beskriver vi prosedyren for implementering av punktvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS) målinger ved hjelp av et klassisk fluorescensmikroskop som er tilpasset. Protokollen inkluderer en spesifikk ytelseskontroll av svFCS-oppsettet og retningslinjene for molekylære diffusjonsmålinger av svFCS på plasmamembranen til levende celler under fysiologiske forhold. I tillegg gir vi en prosedyre for å forstyrre plasmamembranflåte nanodomains ved kolesteroloksidasebehandling og demonstrere hvordan disse endringene i den laterale organisasjonen av plasmamembranen kan avsløres ved svFCS-analyse. Avslutningsvis kan denne fluorescensbaserte metoden gi enestående detaljer om den laterale organisasjonen av plasmamembranen med passende romlig og tidsmessig oppløsning.
Kompleksiteten av plasmamembranorganisasjon
Den nåværende forståelsen av cellemembranorganisasjon må ta hensyn til flere aspekter1. For det første varierer en kompleks lipidsammensetning ikke bare mellom celletyper, men også innenfor en enkelt celle (membranorganeller / plasmamembran). Dessuten er assosierte eller inneboende membranproteiner for det meste organisert i dynamiske multimere komplekser, med store domener som strekker seg utenfor membranen, og står for et betydelig større område enn transmembrandomenene alene. Videre utviser membranassosierte proteiner spesifikke lipidbindende eller lipidinteraksjonerende kapasiteter som spiller roller i regulering av proteinfunksjon. Disse avhenger direkte av den lokale sammensetningen og tilgjengeligheten av lipidene2.
Endelig observeres et signifikant nivå av asymmetri mellom to membranbrosjyrer på grunn av den indre asymmetriske strukturen av membranproteiner og fordelingen av lipider. Faktisk genererer en lipidmetabolismebalanse mellom syntese og hydrolyse, kombinert med lipid flip-flop mellom brosjyrene, en slik asymmetrisk fordeling. Ettersom enhver transport over dobbeltlaget er begrenset av den frie energien som kreves for å flytte den polare hodegruppen gjennom det hydrofobe indre av membranene, blir det vanligvis assistert av selektive transportører. For hver celletype har asymmetri en tendens til å bli godt vedlikeholdt. Til sammen bidrar disse faktorene til lateral inhomogenitet eller compartmentalization av plasmamembranen 3,4.
Vi beriker denne representasjonen av plasmamembranen ved å ta hensyn til den iboende molekylære diffusjonen i og over dobbeltlaget, noe som bidrar til den dynamiske laterale heterogeniteten på en skala fra tiendedeler til hundrevis av nanometer og mikrosekunder til sekunder. For eksempel bidrar lipidavhengige membrannanodomener – de såkalte lipidflåtene, definert som kolesterol og sfingolipidrike signalplattformer – til compartmentalization av plasmamembranen 5,6. Det nåværende synet på membranorganisering er imidlertid ikke begrenset til lipidflåter alene. Membran nanodomener er mer komplekse og heterogene i sammensetning, opprinnelse og funksjon. Likevel må deres tilstedeværelse ved plasmamembranen koordineres tett, og dynamiske interaksjoner mellom proteiner og lipider synes å være viktige i den romlige fordelingen og kjemisk modifikasjon av membran nanodomener 1,3,7,8.
SvFCS-prinsippet og dets anvendelse for å undersøke organisasjonen av plasmamembranen
Selv om det er gjort store fremskritt i analysen av membrandomener, hovedsakelig gjennom biofysiske teknikker, må determinantene som dikterer den lokale organisasjonen av plasmamembranen raffineres med passende romlig og tidsmessig oppløsning. Determinanter basert på sporing av individuelle molekyler gir utmerket romlig presisjon og tillater karakterisering av forskjellige bevegelsesmåter 9,10,11,12, men har en begrenset tidsmessig oppløsning med klassiske lave kamerabildefrekvenser og krever mer eksperimentell innsats for å registrere et betydelig antall baner. Alternativt kan diffusjonskoeffisienten til membrankomponenter evalueres ved fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP)13 eller fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS)14. Sistnevnte har fått mer oppmerksomhet, hovedsakelig på grunn av sin høye følsomhet og selektivitet, mikroskopisk deteksjonsvolum, lav invasivitet og bredt dynamisk område15.
Det konseptuelle grunnlaget for FCS ble introdusert av Magde og kolleger for rundt 50 år sidenfor 16,17. Den er basert på registrering av svingninger i fluorescensutslipp med høy tidsmessig oppløsning (fra μs til s)18. I sin moderne versjon utføres målinger i levende celler av et lite konfokalt eksitasjonsvolum (~ 0,3 femtoliters) plassert innenfor et område av interesse (f.eks. Ved plasmamembranen); fluorescenssignalet som genereres ved å diffundere fluorescerende molekyler som går inn og ut av observasjonsvolumet, samles med svært høy tidsmessig oppløsning (dvs. ankomsttidspunktet for hvert foton på detektoren). Deretter beregnes signalet for å generere autokorrelasjonsfunksjonen (ACF), hvorfra gjennomsnittstiden td (diffusjonstid) som et molekyl holder seg innenfor fokalvolumet ekstraheres, sammen med gjennomsnittlig antall partikler, (N), tilstede i observasjonsvolumet, som er omvendt proporsjonalt med amplituden til ACF. Denne siste parameteren kan være nyttig informasjon om molekylkonsentrasjonen i observasjonsvolumet.
Siden da har et økende antall FCS-modaliteter blitt implementert takket være raskt utviklende instrumentering i biofotonikk, noe som gjør det mulig å beskrive dynamiske fenomener som forekommer i levende systemer. Likevel vil en molekylær art oppleve en mer overlappende fordeling av diffusjonskoeffisientverdiene, som vanligvis reflekteres av en uregelmessig diffusjonskarakteristikk, der molekyler diffunderer med et ikke-lineært forhold i tid19, og vanskeligheter med å identifisere den biologiske betydningen av denne uregelmessige subdiffusjonen. Tidligere har denne vanskeligheten blitt noe overvunnet ved å registrere molekylær diffusjon av FRAP fra områder av forskjellige størrelser, i stedet for fra bare ett område, og dermed gi ytterligere romlig informasjon. Dette muliggjorde for eksempel konseptualisering av membranmikrodomener 20,21,22.
En oversettelse av denne strategien til FCS-målinger (dvs. den såkalte punktvariasjonen Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS)) ble etablert ved å variere størrelsen på fokalvolumet av observasjon, slik at svingningen i fluorescens kunne registreres på forskjellige romlige skalaer23. Dermed gir svFCS-tilnærmingen indirekte romlig informasjon som muliggjør identifisering og bestemmelse av molekylære diffusjonsmoduser og type membranpartisjonering (isolerte versus sammenhengende domener24) av studerte molekyler. Ved å plotte diffusjonstiden td som en funksjon av de forskjellige romlige skalaene definert av midjeverdien (ω), som tilsvarer deteksjonsstrålens radiusstørrelse i dette tilfellet23,25, kan man karakterisere diffusjonsloven til et gitt molekyl i en gitt fysiologisk tilstand. svFCS er derfor en perfekt analog til enkeltpartikkelsporing itidsdomenet 26. Under den brownske diffusjonsbegrensningen bør man forvente et strengt lineært forhold mellom diffusjonstiden td og midjen ω (figur 1)23,25. Opprinnelsen til avviket fra diffusjonsloven fra denne ordningen kan tilskrives ikke-eksklusive årsaker, for eksempel cytoskelettmasking, molekylær trengsel, dynamisk partisjonering i nanodomener, eller en hvilken som helst kombinasjon av disse og andre effekter (figur 1), og må testes eksperimentelt25.
Her gir vi alle nødvendige kontrollpunkter for daglig bruk av et skreddersydd svFCS optisk system bygget fra bunnen av, som utfyller våre tidligere protokollanmeldelser27,28 på den eksperimentelle tilnærmingen. Videre, som et bevis på konseptet, gir vi retningslinjer for kalibrering av oppsettet, fremstilling av celler, datainnsamling og analyse for etablering av svFCS diffusjonslov (DL) for Thy1-GFP, et plasmamembranglykosylfosfatidylinositolforankret protein, som er kjent for å være lokalisert i lipidflåte nanodomains29. Til slutt demonstrerer vi hvordan den delvise destabiliseringen av lipidflåte nanodomainer ved kolesteroloksidasebehandling påvirker diffusjonsegenskapene til Thy1-GFP. I tillegg er en detaljert beskrivelse av å bygge et svFCS-oppsett fra bunnen av gitt i tilleggsmateriale.
Her har vi beskrevet implementeringen av svFCS-modulen på et standard fluorescerende mikroskop, en kraftig eksperimentell tilnærming for å dechiffrere dynamikken i plasmamembranorganisasjonen i levende celler takket være FCS diffusjonslovanalyse. Konseptuelt er svFCS basert på et enkelt prinsipp: korrelasjonsmålinger av fluorescens i tidsdomenet mens du varierer størrelsen på belysningsområdet23. Denne strategien har vært medvirkende til å utlede nanoskopisk informasjon fra mikroskopiske målinger, noe som bidrar til å dechiffrere de viktigste fysisk-kjemiske elementene som bidrar til plasmamembranorganisasjonen i steady state25 og fysiologiske prosesser 30,31,32,33. Til sammen demonstrerer disse svFCS-analysene utvetydig eksistensen av lipidavhengige nanodomener i forskjellige celletyper og deres direkte implikasjoner ved innstilling av forskjellige signalhendelser.
Innenfor dette rammeverket er det noen optiske aspekter som må vurderes mens du bygger svFCS-oppsettet for å optimalisere fotonbudsjettet og minimere optiske avvik. Derfor anbefaler vi å bruke et mikroskop som rørlinsen kan fjernes fra når svFCS-målingen utføres. Videre spiller en enkelt iris en nøkkelrolle i svFCS-oppsettet: den endrer strålestørrelsen ved baksiden av målet, og varierer dermed direkte den effektive midjestørrelsen (dvs. det effektive eksitasjonsvolumet). Strålediameteren skal passe til den objektive bakre eleven for å oppnå den minste midjestørrelsen34. Dette alternativet, som hjelper til med å justere midjestørrelsen, sikrer optimalisering av fotonbudsjettet og er enkelt å implementere. Til slutt brukes et minimalt antall optiske deler langs lysbanen; jo mindre komplekst systemet er, jo færre fotoner går tapt. Alle disse alternativene forbedrer robustheten til svFCS-eksperimenter betydelig.
Når det gjelder selve protokollen, må noen få kritiske trinn vurderes. Det viktigste er en hensiktsmessig justering av de optiske banene som er avgjørende for vellykkede svFCS-målinger (protokoll, avsnitt 2). Dette er enkelt å kontrollere ved å analysere fluorescenssignalet fra en 2 nM Rh6G-løsning, som skal være ~200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alle iriser skal åpnes, og ACFene skal ha en viktig amplitude (typisk G0 ~ 1,5-2,0). Et annet kritisk punkt gjelder cellene og deres forberedelse til svFCS-analyse (protokoll, seksjon 4–8). Dens tetthet må tilpasses slik at isolerte celler som skal observeres, er tilgjengelige for analyse. Ikke-klebende celler må immobiliseres på et kammerglass ved bruk av poly-L-lysinløsning. Fluorescenssignalet fra cellemerking bør ikke være for sterkt, eller det vil resultere i svært flate ACFer som er vanskelige å passe, og passformparametrene er belastet med en viktig feil. I tillegg gjør ikke-homogen merking og fluorescensaggregater i celler svFCS-målingene ekstremt vanskelige å tolke. Endelig påvirker kolesteroloksidasebehandling cellens levedyktighet, og svFCS-analysen bør ikke overstige en time etter behandlingen. Det er også bedre å registrere fluorescensfluktuasjonene fra den øvre plasmamembranen, da den ikke er festet til støtten, og det er ingen risiko for hindret diffusjon av molekyler på grunn av de fysiske interaksjonene med støtten.
Det har vært nok fremskritt i svFCS-teknikken for bruk i forskjellige tilnærminger på grunn av mangfoldet av modaliteter for å justere deteksjonsvolumet, noe som gjør det mulig å studere ulike biologiske prosesser i levende celler. Et alternativ til å justere størrelsen på eksitasjonsvolumet er å bruke en variabel stråleutvidelse35. Det er også mulig å ganske enkelt modulere størrelsen på belysningsområdet ved å registrere det fluorescerende signalet fra avskjæringen av plasmamembranen langs z-retning36. Dette kan gjøres på et standard konfokalt mikroskop som det er utviklet et teoretisk rammeverk for for å utlede diffusjonsloven37,38.
Selv om svFCS-metoden tilbyr spatio-temporal oppløsning, som er nødvendig for karakterisering av den inhomogene laterale organisasjonen av plasmamembranen, er de geometriske modusene for inneslutning ikke gjensidig utelukkende. Et avvik på t0 i den ene eller den andre retningen avslører utelukkende en dominerende modus for innesperring25. Videre er en annen viktig begrensning av den nåværende svFCS-metoden et resultat av den klassiske optiske diffraksjonsgrensen (~ 200 nm). Dette er utvilsomt større enn domenene som begrenser molekylene i celleplasmamembranen. Derfor er analysen av inneslutningen avledet fra t0-verdien , ekstrapolert fra diffusjonsloven.
Denne ulempen har blitt overvunnet ved å implementere alternative metoder. I utgangspunktet ga bruk av metallfilmer boret med nanoapertures muligheten til å belyse et svært lite membranområde (dvs. under den optiske diffraksjonsgrensen for enkelt nanometriske åpninger av radier som varierer mellom 75 og 250 nm) 39. Overgangsregimet spådd fra den teoretiske diffusjonsloven for isolert domeneorganisasjon ble dermed rapportert, og det tillot en forfining av den karakteristiske størrelsen på de nanometriske membran heterogenitetene og et kvantitativt estimat av overflatearealet okkupert av lipidavhengige nanodomener39. Alternativt har nanometrisk belysning også blitt utviklet ved hjelp av nærfeltsskanning optisk mikroskopi40 eller plan optisk nanoantennas41. Mer nylig har kombinasjonen av STIMULERT utslippsutarming (STED) og FCS gitt et kraftig og følsomt verktøy for å dokumentere diffusjonsloven med svært høy romlig oppløsning. Denne STED-FCS gir tilgang til molekylære diffusjonsegenskaper på nanoskala som forekommer innen kort tid, noe som gjør det mulig å studere den dynamiske organisasjonen av lipidprober ved plasmamembranen42,43. Den ufullstendige undertrykkelsen av fluorescens i STED-prosessen utfordrer imidlertid analysen av autokorrelasjonskurvene i FCS.
En ny tilpasningsmodell er utviklet for å overvinne denne vanskeligheten, og forbedre nøyaktigheten av diffusjonstidene og gjennomsnittlige molekyltallmålinger44. Til slutt, for langsom molekylær diffusjon ved plasmamembranen, kan svFCS-prinsippet brukes på data registrert ved bildekorrelasjonsspektroskopi45. Nylig har det blitt vist at kombinasjon av atomkraftmikroskopi (AFM) med avbildning av total intern refleksjon-FCS (ITIR-FCS) bidrar til forfining av mekanismens natur som hindrer molekylær diffusjon ved plasmamembranen, spesielt nær perkolasjonsterskelmembrankonfigurasjonen på grunn av en høy tetthet av nanodomener46.
Avslutningsvis har etablering av diffusjonslov av svFCS gitt eksperimentelle bevis for å utlede lokal heterogenitet skapt av dynamiske kollektive lipider og membranproteiners foreninger. Som det fremgår av Wohland og medarbeidere46, “FCS diffusjonslovanalyse er fortsatt et verdifullt verktøy for å utlede strukturelle og organisatoriske trekk under oppløsningsgrensen fra dynamisk informasjon”. Likevel må vi utvikle nye modeller for å avgrense tolkningen av diffusjonsloven som skal muliggjøre en bedre forståelse av dynamikken til de molekylære hendelsene som forekommer ved plasmamembranen.
The authors have nothing to disclose.
SB, SM og DM ble støttet av institusjonell finansiering fra CNRS, Inserm og Aix-Marseille Universitet og programtilskudd fra det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-17-CE15-0032-01 og ANR-18-CE15-0021-02) og den franske “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW anerkjenner “BioTechNan”, et program for tverrfaglige miljø doktorgradsstudier KNOW innen bioteknologi og nanoteknologi. EB anerkjenner den økonomiske støtten fra National Science Centre of Poland (NCN) under prosjekt nr. 2016/21/D/NZ1/00285, samt den franske regjeringen og Frankrikes ambassade i Polen. MŁ anerkjenner den økonomiske støtten fra det polske utviklingsdepartementet (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) og Nasjonalt senter for forskning og utvikling (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT anerkjenner økonomisk støtte fra National Science Center of Poland (NCN) under prosjekt nr. 2016/21/B/NZ3/00343 og fra Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).
Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz | RS Components | 546-4948 | |
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-347 | |
Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-035-A | |
25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm | Thorlabs | WPH10M-488 (HWP) | |
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
Beam block – active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
Small Optical Rails 75mm, metric | Thorlabs | RLA075/M | |
Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR75/M-P5 | |
USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR30/M | |
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR20/M | |
750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
350 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L350/M | |
Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
PT100 Temperature Sensor | Digital Pixel | DP_P100_TS | |
Biological Reagents and Materials | |||
Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |