Denna artikel syftar till att presentera ett protokoll om hur man bygger ett punktvariationsfluorescens korrelationsspektroskopi (svFCS) mikroskop för att mäta molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler.
Dynamiska biologiska processer i levande celler, inklusive de som är associerade med plasmamembranorganisation, förekommer på olika rumsliga och tidsmässiga skalor, allt från nanometer till mikrometer respektive mikrosekunder till minuter. Ett så brett spektrum av biologiska processer utmanar konventionella mikroskopimetoder. Här beskriver vi proceduren för att implementera spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi (svFCS) mätningar med hjälp av ett klassiskt fluorescensmikroskop som har anpassats. Protokollet innehåller en specifik prestandakontroll av svFCS-installationen och riktlinjerna för molekylära diffusionsmätningar av svFCS på plasmamembranet i levande celler under fysiologiska förhållanden. Dessutom tillhandahåller vi ett förfarande för att störa plasmamembranflottanodomäner genom kolesteroloxidasbehandling och visar hur dessa förändringar i plasmamembranets laterala organisation kan avslöjas genom svFCS-analys. Sammanfattningsvis kan denna fluorescensbaserade metod ge oöverträffade detaljer om plasmamembranets laterala organisation med lämplig rumslig och tidsmässig upplösning.
Komplexiteten i plasmamembranorganisation
Den nuvarande förståelsen av cellmembranorganisation måste ta hänsyn till flera aspekter1. För det första varierar en komplex lipidkomposition inte bara mellan celltyper utan också inom en enda cell (membranorganeller / plasmamembran). Dessutom är associerade eller inneboende membranproteiner mestadels organiserade i dynamiska multimera komplex, med stora domäner som sträcker sig utanför membranet, vilket står för ett betydligt större område än för transmembrandomänerna ensam. Dessutom uppvisar membranassocierade proteiner specifika lipidbindande eller lipid-interagerande kapaciteter som spelar roller för att reglera proteinfunktionen. Dessa beror direkt på den lokala sammansättningen och tillgängligheten av lipiderna2.
Slutligen observeras en signifikant nivå av asymmetri mellan två membranbroschyrer på grund av den inneboende asymmetriska strukturen hos membranproteiner och fördelningen av lipider. Faktum är att en lipidmetabolisk balans mellan syntes och hydrolys, i kombination med lipidflip-flop mellan broschyrerna, genererar en sådan asymmetrisk fördelning. Eftersom all transport över dubbelskiktet begränsas av den fria energi som krävs för att flytta polarhuvudgruppen genom membranens hydrofoba inre, assisteras den vanligtvis av selektiva transportörer. För varje celltyp tenderar asymmetrin att bibehållas ordentligt. Sammantaget bidrar dessa faktorer till lateral inhomogenitet eller uppdelning av plasmamembranet 3,4.
Vi berikar denna representation av plasmamembranet genom att ta hänsyn till den inneboende molekylära diffusionen inom och över dubbelskiktet, vilket bidrar till den dynamiska laterala heterogeniteten på en skala från tiondelar till hundratals nanometer och mikrosekunder till sekunder. Till exempel bidrar lipidberoende membrannanodomäner-de så kallade lipidflottorna, definierade som kolesterol och sfingolipidrika signalplattformar-till uppdelningen av plasmamembranet 5,6. Den nuvarande synen på membranorganisation är dock inte begränsad till lipidflottor ensam. Membrannanodomäner är mer komplexa och heterogena i sammansättning, ursprung och funktion. Ändå måste deras närvaro vid plasmamembranet samordnas tätt, och dynamiska interaktioner mellan proteiner och lipider verkar vara viktiga i den rumsliga fördelningen och kemiska modifieringen av membrannanodomäner 1,3,7,8.
SvFCS-principen och dess tillämpning för att undersöka plasmamembranets organisation
Även om stora framsteg har gjorts i analysen av membrandomäner, främst genom biofysiska tekniker, måste determinanterna som dikterar den lokala organisationen av plasmamembranet förfinas med lämplig rumslig och tidsmässig upplösning. Determinanter baserade på spårning av enskilda molekyler ger utmärkt rumslig precision och möjliggör karakterisering av olika rörelsesätt 9,10,11,12, men har en begränsad tidsupplösning med klassiska låga kamerabildhastigheter och kräver mer experimentell ansträngning för att spela in ett betydande antal banor. Alternativt kan diffusionskoefficienten för membrankomponenter utvärderas genom fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP)13 eller fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)14. Den senare har fått mer uppmärksamhet, främst på grund av dess höga känslighet och selektivitet, mikroskopiska detektionsvolym, låga invasivitet och breda dynamiska omfång15.
Den konceptuella grunden för FCS introducerades av Magde och kollegor för cirka 50 år sedanför 16,17. Den är baserad på registrering av fluktuationen av fluorescensemission med en hög tidsupplösning (från μs till s)18. I sin moderna version utförs mätningar i levande celler av en liten konfokal excitationsvolym (~ 0,3 femtoliter) placerad inom ett område av intresse (t.ex. vid plasmamembranet); fluorescenssignalen som genereras genom att diffundera fluorescerande molekyler som går in och ut ur observationsvolymen samlas in med mycket hög tidsupplösning (dvs. ankomsttiden för varje foton till detektorn). Därefter beräknas signalen för att generera autokorrelationsfunktionen (ACF), från vilken den genomsnittliga tiden td (diffusionstid) för vilken en molekyl stannar inom fokalvolymen extraheras, tillsammans med det genomsnittliga antalet partiklar, (N), närvarande i observationsvolymen, vilket är omvänt proportionellt mot ACF: s amplitud. Denna sista parameter kan vara användbar information om molekylkoncentrationen inom observationsvolymen.
Sedan dess har ett växande antal FCS-modaliteter implementerats tack vare snabbt utvecklande instrumentering i biofotonik, vilket möjliggör beskrivning av dynamiska fenomen som förekommer i levande system. Ändå skulle en molekylär art uppleva en mer överlappande fördelning av diffusionskoefficientvärdena, vilket vanligtvis återspeglas av en avvikande diffusionskarakteristik, där molekyler diffunderar med ett olinjärt förhållande i tid19 och svårigheter att identifiera den biologiska betydelsen av denna avvikande subdiffusion. Tidigare har denna svårighet övervunnits något genom att registrera den molekylära diffusionen av FRAP från områden av olika storlekar, snarare än från bara ett område, vilket ger ytterligare rumslig information. Detta möjliggjorde till exempel konceptualisering av membranmikrodomäner 20,21,22.
En översättning av denna strategi till FCS-mätningar (dvs. den så kallade punktvariationen Fluorescenskorrelationsspektroskopi (svFCS)) fastställdes genom att variera storleken på observationsvolymen, vilket gjorde att fluktuationen i fluorescens kunde registreras på olika rumsliga skalor23. Således tillhandahåller svFCS-metoden indirekt rumslig information som möjliggör identifiering och bestämning av molekylära diffusionslägen och typ av membranpartitionering (isolerad kontra angränsande domäner24) av studerade molekyler. Genom att plotta diffusionstiden td som en funktion av de olika rumsliga skalorna definierade av midjevärdet (ω), vilket motsvarar detektionsstrålens radiestorlek i detta fall23,25, kan man karakterisera diffusionslagen för en given molekyl i ett givet fysiologiskt tillstånd. SvFCS är därför en perfekt analog till enpartikelspårning i tidsdomänen26. Under den brownska diffusionsbegränsningen bör man förvänta sig ett strikt linjärt förhållande mellan diffusionstiden td och midjan ω (figur 1)23,25. Ursprunget till diffusionslagens avvikelse från detta schema kan hänföras till icke-exklusiva skäl, såsom cytoskelettnät, molekylär trängsel, dynamisk partitionering i nanodomäner eller någon kombination av dessa och andra effekter (figur 1), och måste testas experimentellt25.
Här tillhandahåller vi alla nödvändiga kontrollpunkter för daglig användning av ett skräddarsytt svFCS optiskt system byggt från grunden, vilket kompletterar våra tidigare protokollgranskningar27,28 på det experimentella tillvägagångssättet. Vidare, som ett bevis på konceptet, ger vi riktlinjer för kalibrering av installationen, beredning av celler, datainsamling och analys för upprättandet av svFCS diffusionslag (DL) för Thy1-GFP, ett plasmamembran glykosylfosfatidylinositolförankrat protein, som är känt för att vara lokaliserat i lipid-flottnanodomäner 29. Slutligen visar vi hur den partiella destabiliseringen av lipid-raft nanodomäner genom kolesteroloxidasbehandling påverkar diffusionsegenskaperna hos Thy1-GFP. Dessutom finns en detaljerad beskrivning av att bygga en svFCS-installation från grunden i kompletterande material.
Här har vi beskrivit implementeringen av svFCS-modulen på ett standardfluorescerande mikroskop, ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt för att dechiffrera dynamiken i plasmamembranorganisationen i levande celler tack vare FCS-diffusionslagsanalysen. Konceptuellt bygger svFCS på en enkel princip: korrelationsmätningar av fluorescens i tidsdomänen samtidigt som storleken på belysningsområdet23 varierar. Denna strategi har varit avgörande för att härleda nanoskopisk information från mikroskopiska mätningar, vilket hjälper till att dechiffrera de viktigaste fysikalisk-kemiska elementen som bidrar till plasmamembranorganisationen i steady state25 och fysiologiska processer 30,31,32,33. Sammantaget visar dessa svFCS-analyser entydigt förekomsten av lipidberoende nanodomäner i olika celltyper och deras direkta implikation vid inställning av olika signalhändelser.
Inom denna ram finns det några optiska aspekter som måste beaktas när du bygger svFCS-installationen för att optimera fotonbudgeten och minimera optiska avvikelser. Därför rekommenderar vi att du använder ett mikroskop från vilket rörlinsen kan tas bort när svFCS-mätningen utförs. Dessutom spelar en enda iris en nyckelroll i svFCS-installationen: den ändrar strålstorleken vid målets bakre bländare och varierar därmed direkt den effektiva midjestorleken (dvs. den effektiva excitationsvolymen). Stråldiametern ska passa den objektiva bakre pupillen för att få den minsta midjestorleken34. Det här alternativet, som hjälper till att ställa in midjestorleken, säkerställer optimering av fotonbudgeten och är lätt att implementera. Slutligen används ett minimalt antal optiska delar längs ljusvägen; ju mindre komplext systemet är, desto färre fotoner som går förlorade. Alla dessa alternativ förbättrar robustheten hos svFCS-experiment avsevärt.
När det gäller själva protokollet måste några kritiska steg övervägas. Det viktigaste är en lämplig inriktning av de optiska banorna som är avgörande för framgångsrika svFCS-mätningar (protokoll, avsnitt 2). Detta är lätt att kontrollera genom att analysera fluorescenssignalen från en 2 nM Rh6G-lösning, som bör vara ~ 200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alla iris bör öppnas och ACF: erna bör ha en viktig amplitud (vanligtvis G0 ~ 1.5–2.0). En annan kritisk punkt gäller cellerna och deras förberedelser för svFCS-analys (protokoll, avsnitt 4–8). Deras densitet måste anpassas så att isolerade celler som ska observeras är tillgängliga för analys. Icke-vidhäftande celler måste immobiliseras på ett kammare täckt glas med hjälp av poly-L-lysinlösning. Fluorescenssignalen från cellmärkning bör inte vara för stark, annars kommer det att resultera i mycket platta ACF: er som är svåra att passa, och passformsparametrarna belastas med ett viktigt fel. Dessutom gör ickehomogen märkning och fluorescensaggregat i celler svFCS-mätningarna extremt svåra att tolka. Slutligen påverkar kolesteroloxidasbehandling cellviabiliteten, och svFCS-analysen bör inte överstiga en timme efter behandlingen. Det är också bättre att registrera fluorescensfluktuationerna från det övre plasmamembranet eftersom det inte är fäst vid stödet, och det finns ingen risk för hindrad diffusion av molekyler på grund av de fysiska interaktionerna med stödet.
Det har gjorts tillräckligt med framsteg inom svFCS-tekniken för dess användning i olika tillvägagångssätt på grund av mångfalden av metoder för att justera detektionsvolymen, vilket gör det möjligt att studera olika biologiska processer i levande celler. Ett alternativ till att justera storleken på excitationsvolymen är att använda en variabel strålutvidgare35. Det är också möjligt att helt enkelt modulera storleken på belysningsområdet genom att spela in den fluorescerande signalen från plasmamembranets avlyssning längs z-riktningen36. Detta kan göras på ett standardkonfokalmikroskop för vilket ett teoretiskt ramverk har utvecklats för att härleda diffusionslagen37,38.
Även om svFCS-metoden erbjuder spatio-temporal upplösning, vilket är nödvändigt för karakterisering av plasmamembranets inhomogena laterala organisation, utesluter inte de geometriska inneslutningssätten varandra. En avvikelse på t0 i den ena eller den andra riktningen avslöjar uteslutande ett dominerande inneslutningssätt25. Dessutom är en annan viktig begränsning av den nuvarande svFCS-metoden resultatet av den klassiska optiska diffraktionsgränsen (~ 200 nm). Detta är utan tvekan större än domänerna som begränsar molekylerna i cellplasmamembranet. Därför härleds analysen av inneslutningen från t0-värdet , extrapolerat från diffusionslagen.
Denna nackdel har övervunnits genom att implementera alternativa metoder. Inledningsvis erbjöd användning av metallfilmer borrade med nanoaperturer möjligheten att belysa ett mycket litet membranområde (dvs. under den optiska diffraktionsgränsen för enstaka nanometriska bländare med radier som varierar mellan 75 och 250 nm)39. Övergångsregimen som förutspåddes från den teoretiska diffusionslagen för isolerad domänorganisation rapporterades således, och den möjliggjorde en förfining av den karakteristiska storleken på de nanometriska membranheterogeniteterna och en kvantitativ uppskattning av ytan som upptas av lipidberoende nanodomäner39. Alternativt har nanometrisk belysning också utvecklats med hjälp av optisk mikroskopi för närfältsskanning40 eller plana optiska nanoantenner41. På senare tid har kombinationen av stimulerad utsläppsutarmning (STED) och FCS gett ett kraftfullt och känsligt verktyg för att dokumentera diffusionslagen med mycket hög rumslig upplösning. Denna STED-FCS ger tillgång till molekylära diffusionsegenskaper på nanoskala som inträffar inom en kort tidsperiod, vilket möjliggör studier av den dynamiska organisationen av lipidprober vid plasmamembranet42,43. Den ofullständiga undertryckandet av fluorescens i STED-processen utmanar dock analysen av de automatiska korrelationskurvorna i FCS.
En ny anpassningsmodell har utvecklats för att övervinna denna svårighet, vilket förbättrar noggrannheten i diffusionstiderna och genomsnittliga molekylnummermätningar44. Slutligen, för långsam molekylär diffusion vid plasmamembranet, kan svFCS-principen tillämpas på data som registrerats med bildkorrelationsspektroskopi45. Nyligen har det visats att kombinationen av atomkraftsmikroskopi (AFM) med avbildning av total intern reflektion-FCS (ITIR-FCS) bidrar till förfining av mekanismens natur som hindrar molekylär diffusion vid plasmamembranet, särskilt nära perkolationströskelmembrankonfigurationen på grund av en hög densitet av nanodomäner46.
Sammanfattningsvis har upprättandet av diffusionslag av svFCS gett experimentella bevis för att dra slutsatsen om lokal heterogenitet skapad av dynamiska kollektiva lipider och membranproteiners föreningar. Som anges av Wohland och medarbetare46, “FCS diffusionslagsanalys är fortfarande ett värdefullt verktyg för att härleda strukturella och organisatoriska funktioner under upplösningsgränsen från dynamisk information”. Ändå behöver vi utveckla nya modeller för att förfina tolkningen av diffusionslagen som ska möjliggöra en bättre förståelse av dynamiken i de molekylära händelser som inträffar vid plasmamembranet.
The authors have nothing to disclose.
SB, SM och DM stöddes av institutionell finansiering från CNRS, Inserm och Aix-Marseille University och programbidrag från den franska nationella forskningsbyrån (ANR-17-CE15-0032-01 och ANR-18-CE15-0021-02) och den franska “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW erkänner “BioTechNan”, ett program för tvärvetenskapliga miljödoktorander KNOW inom bioteknik och nanoteknik. EB erkänner det ekonomiska stödet från Polens nationella vetenskapscenter (NCN) under projekt nr 2016/21/D/NZ1/00285, liksom den franska regeringen och Frankrikes ambassad i Polen. MŁ erkänner det ekonomiska stödet från det polska utvecklingsministeriet (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) och National Center for Research and Development (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT erkänner ekonomiskt stöd från National Science Center of Poland (NCN) under projekt nr 2016/21/B/NZ3/00343 och från Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).
Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz | RS Components | 546-4948 | |
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-347 | |
Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-035-A | |
25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm | Thorlabs | WPH10M-488 (HWP) | |
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
Beam block – active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
Small Optical Rails 75mm, metric | Thorlabs | RLA075/M | |
Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR75/M-P5 | |
USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR30/M | |
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR20/M | |
750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
350 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L350/M | |
Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
PT100 Temperature Sensor | Digital Pixel | DP_P100_TS | |
Biological Reagents and Materials | |||
Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |