Denna artikel presenterar en serie på varandra följande metoder för uttryck och rening av Salmonella typhimurium tryptofan syntas comp detta protokoll ett snabbt system för att rena proteinkomplexet på en dag. Täckta metoder är platsstyrd mutagenes, proteinuttryck i Escherichia coli,affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi och kristallisering.
Strukturella studier med tryptofansyntas (TS) bienzym komplexa (α2β2 TS) från Salmonella typhimurium har utförts för att bättre förstå dess katalytiska mekanism, allosteriskt beteende och detaljer om enzymatiska omvandlingen av substrat till produkt i PLP-beroende enzymer. I detta arbete tillät ett nytt uttryckssystem för att producera den isolerade α- och isolerade β-underenheten rening av höga mängder rena underenheter och α2β2StTS-komplex från de isolerade underenheterna inom 2 dagar. Rening utfördes av affinitet kromatografi följt av klyvning av affinitet taggen, ammonium sulfat nederbörd och storlek uteslutning kromatografi (SEC). För att bättre förstå rollen av viktiga rester vid enzymet β-site, utfördes site-direct mutagenesis i tidigare strukturella studier. Ett annat protokoll skapades för att rena den vilda typen och mutanta α2β2StTS-komplex. Ett enkelt, snabbt och effektivt protokoll med ammoniumsulfatfraktion och SEC tillät rening av α2β2StTS-komplex på en enda dag. Båda rening protokoll som beskrivs i detta arbete har betydande fördelar jämfört med tidigare protokoll att rena samma komplex med PEG 8000 och spermin för att kristallisera α2β2StTS komplex längs reningsprotokollet. Kristallisering av vild typ och vissa mutantformer sker under lite olika förhållanden, vilket försämrar reningen av vissa mutanter med PEG 8000 och spermin. För att förbereda kristaller som lämpar sig för röntgenkristallkroografiska studier gjordes flera ansträngningar för att optimera kristallisering, kristallkvalitet och kryoprotection. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för rening av tryptofansyntasunderenheter och vilda typer och mutanta α2β2StTS-komplex.
Tryptofansyntas (TS) bienzymkomplex (α2β2) är ett allosteriskt enzym som katalyserar de två sista stegen i biosyntesen av aminosyran L-tryptofan i bakterier, växter ochsvampar 1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) orsakar en allvarlig gastrointestinal infektion hos människor och andra djur. Eftersom människor och högre djur inte har TS (EG 4.2.1.20), hämmas S. typhimurium α2β2 TS-komplex (α2β2StTS) har utforskats som ett potentiellt läkemedelsmål för behandling av cryptosporidiosis och tuberkulos4,genitala och okulär infektioner5, och för potentiell herbicidutnyttjande inom jordbruket6. α-underenheten katalyserar den aldolytiska klyvningen av indol-3-glycerol-fosfat (IGP) till glyceraldehyd-3-fosfat (GAP) och indol, genom bildandet av en indolenin tautomer mellanliggande och därefter kol-kol-kolbindning klyvning för att producera GAP och indol3,6. Den β katalytiska platsen innehåller en pyridoxal 5′-fosfat (PLP) kofaktormolekyl bunden till β-Lys87 via en Schiff-bas, som fungerar som en elektronsänka under reaktionerna vid enzymet β-underavdelning3,7. Den β katalyserar ersättningen av L-Serine sidokedjan hydroxyl med indol för att ge L-tryptofan och en vattenmolekyl i en PLP-beroende reaktion. St (st) TS fungerar som en långvarig modell för undersökning av substratkanalning och allosterisk kommunikation inom multienzymkomplex2,3. Dubbelriktad allosterisk kommunikation mellan α- och β-underenheterna av TS är nödvändig för att synkronisera katalytiska steg och förhindra indolfrisättning under L-Tryptofan syntes3. För att utöka denna ansträngning har vi förberett flera mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr och β-Ser377Ala) genom enpunktsmutation som ska användas i ytterligare utforskningar av förhållandet mellan enzymstruktur, mekanism och funktion på den katalytiska platsen för StTS β-underenheten.
Detaljerad forskning om katalystalmekanismen i α2β2StTS initierades av forskargruppen Edith W. Miles. Tidiga studier med infödda Escherichia coli α2β2 TS-komplex har fokuserat på rening och karakterisering av den isolerade α-underenheten8,9, isolerad β-underavdelning10,11 och rekonstitution av α2β2 TS-komplexet från de isolerade underenheterna12. Rening utfördes genom ammoniumsulfatutfällning, provdialys, DEAE-Sephadex kromatografi, dialys och en andra kromatografisk runda på en DEAE-Sephadex kolumn12. I ett annat protokoll förbättrades reningen av samma komplex genom att ladda det klarnade celllyatet på en DEAE-Sephadex-kolumn följt av ett kromatografiskt steg på en Sepharose 4B-kolumn, ammoniumsulfatutfällning och dialys13. Båda reningsprotokollen varar i 4-5 dagar. Escherichia coli α2β2 TS-komplex kristalliserade men kristaller var inte lämpliga för röntgendiffraktion vid den tiden.
I en ny studie renades rekombinanta och vilda typer av S. typhimurium α2β2 TS-komplex och kristalliserades14,15. Rekombinanta α2β2StTS-komplexet var överuttryckt i E. coli stam CB149 bär pEBA-10 uttryck vektor. Inledande kristallisering och röntgen diffraktion data insamling och analys av α2β2StTS-komplex rapporterades14. Långa och tunna nål som α2β2StTS kristaller nedsatta strukturella studier. I ett försök att samla in bättre röntgendiffraktionsdata beskrevs ett annat reningsprotokoll för att rena den vilda typen och mutantformerna av α2β2StTS-komplexet15. Rening utfördes med en första nederbörd med spermin och PEG 8,000 i den klarnade cell lysatet och en stor skrymmande fällning togs bort genom centrifugation. Den supernatanta fraktionen som innehåller höga mängder α2β2StTS-komplexet lagrades i 16-48 h vid 4 °C tills gula kristaller fälldes ut. Kristaller tvättades och i stor utsträckning dialyserades mot olika buffertar. Protein komplexa var rekristallized i buffert som innehåller ammonium sulfat och dialyzed15. Även om proteinkristallisering beror på protein- och utfällningskoncentrationer i lösningen, är det svårt att övervaka, förutsäga och reproducera rening för andra mutanta former av α2β2StTS-komplex i lösning. Detta protokoll har fördelen att det inte använder några kromatografiska metoder; Nackdelarna är dock den långa reningstiden som krävs för att kristallisera, dialysera och omkristallisera, vilket vanligtvis kräver 5-7 dagar. För att erhålla kristaller som lämpar sig för insamling av röntgendata utvärderades mer än 600 kristalliseringsförhållanden med hjälp av en kombination och variation av proteinkoncentration, temperatur, fällningsmedel (PEG 4 000, 6 000 och 8 000) och tillsatser (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadaverine, putrescine, spermin eller spermidin)15. Kristaller hade en bättre kristallin form och växte snabbare under förhållanden som innehöll 12% PEG 8,000 och 2 mM spermin. Kristallisering var mer gynnsam vid 25 °C snarare än vid 4, 30 eller 42 °C och växte till maximala dimensioner inom 3 dagar15. Flera α2β2StTS kristallstrukturer rapporterades vid den tiden (1996-1999)16,17,18,19,20,21 och många andra strukturer har publicerats hittills.
Här är huvudsyftet att presentera alternativa protokoll för att rena tryptofansyntas och optimera proteinkristallisering. Det nuvarande arbetet visar betydande förbättringar för att rena den vilda typen isolerad α-underavdelning (αStTS), isolerad β-underenhet (βStTS), rekonstituerad α2β2StTS-komplex från isolerade underenheter och vilda typer och mutantformer av α2β2StTS-komplexet. Fördelarna jämfört med tidigare protokoll är betydande eftersom reningstiden minskade betydligt och kristallisering och kryoprotection optimerades. Mutanta former av α2β2StTS-komplex som konstruerats i detta arbete har kristalliserats nära samma tillstånd som används för den vilda typen form. Fin kristallisering optimering var dock nödvändigt att erhålla stora enskilda kristaller av tillräcklig kvalitet för struktur bestämning vid nära atomupplösning. Hittills finns det 134 tryptofansyntaskristallstrukturer deponerade i Protein Data Bank (PDB), som står 101, 31 respektive 2 kristallstrukturer för bakterier, arkéer och eukaryote. Snyggt, 73 strukturer tillhör S. enterica serovar typhimurium och 5 kristallstrukturer i α2β2StTS-komplexet har upplösningsgränser högre än 1,50 Angstroms. Föga förvånande förbereddes 4 av 5 i vår forskargrupp (PDB ID:5CGQ på 1.18 Å, 4HT3 kl 1.30 Å, 4HPJ kl 1.45 Å, 6DZ4 kl 1.45 Å upplösning). De raffinerade kristallstrukturerna i mutantformen α2β2StTS-komplexet förväntas ge nya insikter om mekanismen och rollerna som spelas av essentiella aminosyrarester som är involverade i L-tryptofansyntesen.
Vi har framgångsrikt konstruerat mutantform α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T och α2β2 βS377A StTS-komplex för strukturfunktionskorrelationsstudier. Inledningsvis har vi försökt rena mutanterna med hjälp av ett tidigare reningsprotokoll22, som kräver α2β2StTS-komplex kristallisering med PEG 8000 och spermin under rening. Även om kristalliseringshastigheten beror på mutantformen och p…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av US National Institute of Health (GM097569).
15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |