PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Summary

Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av Salmonella typhimurium tryptofan synthase comp denne protokollen et raskt system for å rense proteinkomplekset på en dag. Dekkede metoder er stedsstyrt mutagenese, proteinuttrykk i Escherichia coli, affinitetskromatografi, gelfiltreringskromatografi og krystallisering.

Abstract

Strukturelle studier med tryptofan synthase (TS) bienzymekompleks (α₂β₂ TS) fra Salmonella typhimurium har blitt utført for å bedre forstå sin katalytiske mekanisme, allosterisk oppførsel og detaljer om den enzymatiske transformasjonen av substrat til produkt i PLP-avhengige enzymer. I dette arbeidet tillot et nytt uttrykkssystem for å produsere de isolerte α- og isolerte β-underenhet rensing av høye mengder rene underenheter og α₂β₂StTS-komplekset fra de isolerte underenhetene innen 2 dager. Rensing ble utført av affinitetskromatografi etterfulgt av spalting av affinitetstaggen, ammoniumsulfatutfelling og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). For bedre å forstå rollen som viktige rester ved enzymet β stedet, ble steds-direkte mutagenese utført i tidligere strukturelle studier. En annen protokoll ble opprettet for å rense den ville typen og mutanten α₂β₂StTS-komplekser. En enkel, rask og effektiv protokoll ved hjelp av ammoniumsulfatfraksjonering og SEC tillot rensing av α₂β₂StTS-kompleks på en enkelt dag. Begge renseprotokollene beskrevet i dette arbeidet har betydelige fordeler sammenlignet med tidligere protokoller for å rense det samme komplekset ved hjelp av PEG 8000 og spermin for å krystallisere α₂β₂StTS-komplekset langs renselsesprotokollen. Krystallisering av vill type og noen mutante former skjer under litt forskjellige forhold, svekker rensingen av noen mutanter ved hjelp av PEG 8000 og spermin. For å forberede krystaller egnet for røntgenkrystallografiske studier ble det gjort flere anstrengelser for å optimalisere krystallisering, krystallkvalitet og kryoproteksjon. Metodene som presenteres her bør generelt gjelde for rensing av tryptofan synthase underenheter og vill type og mutant α₂β₂StTS komplekser.

Introduction

Tryptofan syntase (TS) bienzymekomplekset (α₂β₂) er et allosterisk enzym, katalyserer de to siste trinnene i biosyntesen av aminosyren L-Tryptofan i bakterier, planter og sopp^1,2,3. Bakterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) forårsaker en alvorlig gastrointestinal infeksjon hos mennesker og andre dyr. Siden mennesker og høyere dyr ikke har TS (EC 4.2.1.20), hemming av S. typhimurium α₂β₂ TS-kompleks (α₂β₂StTS) har blitt utforsket som et potensielt legemiddelmål for behandling av kryptosporidiose og tuberkulose⁴, kjønns- og okulære infeksjoner⁵, og for potensiell herbicidutnyttelse i^{landbruket 6}. Den α-subenhet katalyserer den aldolytiske spaltingen av indole-3-glyserol-fosfat (IGP) til glyseraldehyd-3-fosfat (GAP) og indole, gjennom dannelsen av en indolenin tautomer mellomliggende og deretter karbonkarbonbinding spalting for å produsere GAP og indole^3,6. Det β-katalytiske stedet inneholder et pyridoksalt 5′-fosfat (PLP) kofaktormolekyl bundet til β-Lys87 via en Schiff-base, som fungerer som en elektron vask i løpet av reaksjonene ved enzymet β-subenhet^3,7. Det β stedet katalyserer utskifting av L-Serine sidekjedehydroksyl med indole for å gi L-Tryptophan og et vannmolekyl i en PLP-avhengig reaksjon. St TS fungerer som en langvarig modell for undersøkelse av substratkanal og allosterisk kommunikasjon innen multienzymkomplekser^2,3. Toveis allosterisk kommunikasjon mellom α- og β-underenheter av TS er nødvendig for å synkronisere katalytiske trinn og forhindre indole-frigjøring under L-Tryptophan syntese³. For å utvide denne innsatsen har vi forberedt flere mutanter (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr og β-Ser377Ala) ved enkeltpunktmutasjon som skal brukes i videre undersøkelser av forholdet mellom enzymstruktur, mekanisme og funksjon på det katalytiske stedet til StTS-β-underenheten.

Detaljert forskning på den katalytiske mekanismen til α₂β₂StTS ble initiert av forskningsgruppen Edith W. Miles. Tidlige studier med innfødt Escherichia coli α₂β₂ TS-komplekset har fokusert på rensing og karakterisering av den isolerte α-subenhet^8,9, isolert β-subenhet^10,11 og rekonstituering av α₂β₂ TS-komplekset fra de isolerte underenhetene¹². Rensing ble utført av ammoniumsulfatutfelling, prøvedialyse, DEAE-Sephadex-kromatografi, dialyse og en andre kromatografisk runde på en DEAE-Sephadex kolonne¹². I en annen protokoll ble rensingen av det samme komplekset forbedret ved å laste inn det avklarte cellelysatet på en DEAE-Sephadex-kolonne etterfulgt av et kromatografisk trinn på en Sepharose 4B-kolonne, ammoniumsulfatutfelling og dialyse¹³. Begge renseprotokollene varer i 4-5 dager. Escherichia coli α₂β₂ TS kompleks krystallisert, men krystaller var ikke egnet for røntgendiffraksjon på den tiden.

I en ny studie ble rekombinante og ville type former for S. typhimurium α₂β₂ TS-komplekset renset og krystallisert^14,15. Det rekombinante α₂β₂StTS-komplekset ble overekspressert i E. coli-stammen CB149 med pEBA-10-uttrykksvektoren. Innledende krystallisering og røntgendiffraksjonsdatainnsamling og analyse av α₂β₂StTS-komplekset ble rapportert¹⁴. Men lang og tynn nål som α₂β₂StTS krystaller svekket strukturelle studier. I et forsøk på å samle inn bedre røntgendiffraksjonsdata, ble en annen renselsesprotokoll beskrevet for å rense den ville typen og mutantformene til α₂β₂StTS-komplekset¹⁵. Rensing ble utført med en innledende nedbør ved hjelp av spermin og PEG 8000 i den avklarte cellelysen og et stort klumpete bunnfall ble fjernet ved sentrifugering. Den supernatante fraksjonen som inneholder høye mengder α₂β₂StTS-komplekset ble lagret i 16-48 timer ved 4 °C til gule krystaller ble utfelt. Krystaller ble vasket og omfattende dialysert mot forskjellige buffere. Proteinkomplekset ble rekrystallisert i buffer som inneholder ammoniumsulfat og dialysert¹⁵. Selv om proteinkrystallisering avhenger av protein- og utfellingskonsentrasjoner i oppløsning, er det vanskelig å overvåke, forutsi og reprodusere rensing for andre mutante former for α₂β₂StTS-kompleks i løsningen. Denne protokollen har fordelen at den ikke bruker noen kromatografiske metoder; Ulempene er imidlertid den lange rensetiden som er nødvendig for å krystallisere, dialyze og rekrystallisere, som vanligvis krever 5-7 dager. For å få krystaller som er egnet for innsamling av røntgendata, mer enn 600 krystalliseringsbetingelser ble evaluert ved hjelp av en kombinasjon og variasjon av proteinkonsentrasjon, temperatur, utfellingsmidler (PEG 4000, 6000 og 8000) og tilsetningsstoffer (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, kadaverin, putrescin, spermin eller spermidin)¹⁵. Krystaller hadde en bedre krystallinsk form og vokste raskere under forhold som inneholder 12% PEG 8000 og 2 mM spermin. Krystallisering var gunstigere ved 25 °C i stedet for ved 4, 30 eller 42 °C og vokste til maksimale dimensjoner innen 3 dager¹⁵. Flere α₂β₂StTS krystallstrukturer ble rapportert på den tiden (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} og mange andre strukturer har blitt publisert til dags dato.

Her er hovedformålet å presentere alternative protokoller for å rense tryptofan syntase og optimalisere proteinkrystallisering. Det nåværende arbeidet viser betydelige forbedringer for å rense den ville typen isolert α-subenhet (αStTS), isolert β-underenhet (βStTS), rekonstituert α₂β₂StTS-kompleks fra de isolerte underenhetene, og villtype og mutantformer av α₂β₂StTS-komplekset. Fordelene i forhold til tidligere protokoller er betydelige siden rensetiden ble redusert betydelig og krystallisering og kryobeskyttelse ble optimalisert. Mutante former for α₂β₂StTS-kompleks konstruert i dette arbeidet har krystallisert nær samme tilstand som brukes til villtypeformen. Imidlertid var fin krystalliseringsoptimalisering nødvendig for å oppnå store enkeltkrystaller av tilstrekkelig kvalitet for strukturbestemmelse ved nær atomoppløsning. Til dags dato er det 134 tryptofan synthase krystallstrukturer deponert i Protein Data Bank (PDB), regnskap 101, 31 og 2 krystallstrukturer, henholdsvis for bakterier, arkaea og eukaryote. Pent tilhører 73 strukturer S. enterica serovar typhimurium og 5 krystallstrukturer av α₂β₂StTS-komplekset har oppløsningsgrenser høyere enn 1,50 Angstroms. Ikke overraskende ble det utarbeidet 4 av 5 i vår forskningsgruppe (PDB IDs:5CGQ at 1.18 Å, 4HT3 at 1.30 Å, 4HPJ at 1.45 Å, 6DZ4 at 1.45 Å resolution). De raffinerte krystallstrukturene til mutantformen av α₂β₂StTS-komplekset forventes å gi ny innsikt i mekanismen og rollene som spilles av essensielle aminosyrerester involvert i L-Tryptofan syntese.

Protocol

1. Rask protokoll for å rense α- og β-underenhet og rekombinert α2β2StTS-komplekset DNA-subkluering i pETSUMO-uttrykksvektorFå oversettelsesbindende gen (trpA og trpB) som koder α- og β-underenheter av tryptofansyntase fra bakterien Salmonella enterica serovar typhimurium klonet i pEBA-10 uttrykksvektor22. Bruk pEBA-10 vektor som en DNA-mal.MERK: Alternativt kan de oppførte primerne nedenfor brukes ti…

Representative Results

Rensing av α- og β-underenheter av tryptofansyntaseDen α-underenheten (αStTS) og β-subenheten (βStTS) av Salmonella typhimurium tryptofan synthase ble subklonert i den modifiserte pET SUMO-vektoren. Figur 1A viser representative SDS-PAGE-resultater av to sterke bånd som tilsvarer fusjonsproteinet His6-SUMO-αStTS (lane αON) og His6-SU…

Discussion

Vi har vellykket konstruert mutantform α₂β₂ βQ114A, α₂β_{2 βK167T,} og α₂β₂ βS377A StTS-komplekser for strukturfunksjonskorrelasjonsstudier. I utgangspunktet har vi forsøkt å rense mutantene ved hjelp av en tidligere renselsesprotokoll²², som krever α₂β₂StTS kompleks krystallisering med PEG 8000 og spermin under rensing. Selv om krystalliseringshastigheten avhenger av mutantformen og…

Materials

15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemical
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotic
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemical
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotic
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemical
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemical
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotic
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemical
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemical
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease