הכנת פיגומים בכליות Decellularized בחולדות
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה לפיתוח פיגום באמצעות כליות חולדה decellularized. הפרוטוקול כולל תהליכי דקלולריזציה ורסקולריזציה כדי לאשר זמינות ביולוגית. Decellularization מבוצעת באמצעות טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט.
Abstract
הנדסת רקמות היא משמעת חדשנית בביו-רפואה. טכניקות תרבות התא ניתן ליישם עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. פיגומים נדרשים כדי להקל על הדור של איברים תלת מימדיים או רקמות באמצעות תאי גזע מובחנים vivo. בדו”ח זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לפיתוח פיגומים וסקולריים באמצעות כליות חולדה decellularized. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי בנות שמונה שבועות, והפרין הוזרק ללב כדי להקל על הזרימה לכלי הכליה, מה שאיפשר להפרין לחלחל לכלי הכליה. חלל הבטן נפתח והכליה השמאלית נאספה. הכליות שנאספו היו perfused במשך 9 שעות באמצעות חומרי ניקוי, כגון טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט, כדי decellularize את הרקמה. פיגומים בכליות Decellularized נשטפו בעדינות עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין והפרין כדי להסיר פסולת הסלולר ושאריות כימיות. השתלת תאי גזע עם פיגומי כלי דם decellularized צפוי להקל על הדור של איברים חדשים. לכן, פיגומים vascularized עשוי לספק בסיס להנדסת רקמות של שתלי איברים בעתיד.
Introduction
טכניקות תרבית תאים מיושמות עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. השתלת איברים אלוגנית היא כיום הטיפול הנפוץ ביותר לנזק בלתי הפיך לאיברים; עם זאת, גישה זו דורשת שימוש בדיכוי המערכת החיסונית כדי למנוע דחייה של האיבר המושתל. יתר על כן, למרות ההתקדמות באימונולוגיה של ההשתלה, 20% ממקבלי ההשתלה עלולים לחוות דחייה חריפה בתוך 5 שנים, ובתוך 10 שנים לאחר ההשתלה, 40% מהמטופלים עלולים לאבד את השתל המושתל שלהם או למות1.
ההתקדמות בטכנולוגיות להנדסת רקמות הניבה פרדיגמה חדשה להשתלת איברים חדשים ללא דחייה חיסונית באמצעות תאי גזע מובחנים. לאחר בידול תאי גזע, יש צורך בפיגום, הנקרא מטריצה חוץ-תאית סינתטית, כדי להקל על יצירת איברים תלת מימדיים ולאפשר לרקמה החדשה לשגשג בתוך המטופל. פיגומים מאיברים מקומיים decellularized יש יתרונות, כולל סביבה יעילה יותר להקמת תאים ושיפור התפשטות תאי גזע, אם כי מנגנונים אלה לא הובהרו במלואם2. בפרט, הכליה היא איבר מתאים לייצור פיגומים כי יש לה זרימת דם בשפע נישה להקמת תאי גזע. בנוסף, בגלל המבנה המורכב של הכליה, קשה לחדש באופן מלאכותי כליות להשתלת איברים.
בדו”ח זה, אנו מציגים שיטה של פיתוח פיגומים vascularized באמצעות איברים decellularized במודל חולדה כדי להקל על מחקרים עתידיים בבעלי חיים למטרות הנדסת רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים שונים שימשו decellularization של איברים ורקמות אחרות. פרוטוקול decellularization האופטימלי צריך לשמר את הארכיטקטורה התלת מימדית של המטריצה החוץ תאית (ECM). באופן כללי, פרוטוקולים כאלה מורכבים lysing קרום התא על ידי עיבוד פיזי או פתרונות יוניים, ניתוק הציטופלסמה והגרעין מן ECM על ידי עיבוד אנזימטי או ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מכון מחקר ביו-רפואי מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי פוסאן.
Materials
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
