Måling av strial blodstrøm i mus cochlea utnytte et åpent fartøy-vindu og intravital fluorescens mikroskopi

Summary

En åpen fartøy-vindu tilnærming ved hjelp av fluorescerende tracers gir tilstrekkelig oppløsning for cochlear blodstrøm (CoBF) måling. Metoden letter studiet av strukturelle og funksjonelle endringer i CoBF i mus under normale og patologiske forhold.

Abstract

Transduksjon av lyd er metabolsk krevende, og mikrovaskulaturens normale funksjon i sideveggen er avgjørende for å opprettholde endokokrometarpotensial, ionetransport og væskebalanse. Ulike former for hørselsforstyrrelser er rapportert å involvere unormal mikrosirkulasjon i sneglehuset. Undersøkelse av hvordan cochlear blodstrøm (CoBF) patologi påvirker hørselsfunksjonen er utfordrende på grunn av mangel på gjennomførbare avhørsmetoder og vanskeligheten med å få tilgang til det indre øret. Et åpent karvindu i den laterale sneglehusveggen, kombinert med fluorescens intravital mikroskopi, har blitt brukt til å studere CoBF-endringer in vivo, men mest hos marsvin og først nylig i musen. Dette papiret og tilhørende video beskriver den åpne fartøy-vindusmetoden for å visualisere blodstrømmen i musesneglehuset. Detaljer inkluderer 1) fremstilling av fluorescerende merket blodcellesuspensjon fra mus; 2) konstruksjon av et åpent fartøyvindu for intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling av blodstrømningshastighet og volum ved hjelp av et offline opptak av avbildningen. Metoden presenteres i videoformat for å vise hvordan man bruker åpen vindustilnærming i mus for å undersøke strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjon under normale og patologiske forhold.

Introduction

Normal funksjon av mikrosirkulasjonen i den laterale cochleaveggen (som omfatter flertallet av kapillærene i spiralligamentet og stria vascularis) er kritisk viktig for å opprettholde hørselsfunksjon¹. Unormal CoBF er involvert i patofysiologien til mange indre øreforstyrrelser, inkludert støyindusert hørselstap, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF vil muliggjøre en bedre forståelse av sammenhengen mellom hørselsfunksjon og cochlear vaskulær patologi.

Selv om kompleksiteten og plasseringen av sneglehuset i tinningbenet utelukker direkte visualisering og måling av CoBF, er det utviklet ulike metoder for vurdering av CoBF, inkludert laserdoppler-flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansavbildning (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15^, endoskopisk laserspekkelkontrastavbildning (LSCI)¹⁶ , og tilnærminger basert på injeksjon av merkede markører og radioaktivt merkede mikrosfærer i blodet (optisk mikroangiografi, OMAG)^17,18,19,20. Ingen av disse metodene har imidlertid aktivert absolutt sanntidssporing av endringer i CoBF in vivo, med unntak av FIVM. FIVM, i kombinasjon med et fartøyvindu i den laterale cochlearveggen, er en tilnærming som har blitt brukt og validert i marsvin under forskjellige eksperimentelle forhold av ulike laboratorier 14,21,22.

En FIVM-metode ble vellykket etablert for å studere strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjonen i mus ved bruk av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran som kontrastmedium og et fluorescensfargestoff – enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, green) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red)-for forhåndsmerking av blodceller, visualisering av kar og sporing av blodstrømningshastighet. I denne studien er protokollen for denne metoden beskrevet for avbildning og kvantifisering av endringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (for eksempel etter støyeksponering). Denne teknikken gir forskeren verktøyene som trengs for å undersøke de underliggende mekanismene til CoBF relatert til hørselsdysfunksjon og patologi i stria vascularis, spesielt når de brukes sammen med lett tilgjengelige transgene musemodeller.

Protocol

MERK: Dette er en ikke-overlevelsesoperasjon. Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Oregon Health &Science University (IACUC godkjenningsnummer: TR01_IP00000968). 1. Fremstilling av fluorescerende merkede blodceller Bedøv donormusene (mannlige C57BL/6J-mus i alderen ~6 uker) med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av ketamin/xylazinbedøvelsesløsning (5 ml/kg, se materialtabellen)….

Representative Results

Etter kirurgisk eksponering av cochlea-kapillærene i sideveggen (figur 1) var intravital høyoppløselig fluorescensmikroskopisk observasjon av dilmerkede blodceller i FITC-dextran-merkede kar mulig gjennom et åpent fartøyvindu. Figur 2A er et representativt bilde tatt under FIVM som viser kapillærene til musecochlear apex-midtre sving sidevegg. Lumina av disse fartøyene er synliggjort av fluorescensen av FITC-dextran blande…

Discussion

Dette papiret demonstrerer hvordan kapillærene i cochlear lateral veggen (og i stria vascularis) av en musemodell kan visualiseres med fluoroformerking i et åpent fartøy-vindu forberedelse under et FIVM-system. Musmodell er mye brukt og foretrukket som en pattedyrmodell for å undersøke menneskers helse og sykdom. Protokollen beskrevet her er en mulig tilnærming for avbildning og undersøkelse av CoBF i musens sidevegg (spesielt i stria vascularis) ved bruk av et åpent fartøyvindu under FIVM-system Metoden gir til…

Materials

0.9% Sodium Chloride	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL (for 1 mL)
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA Monitor system	Kent scientific		CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Measurement of vessel diameter
FITC-dextran (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Heparin Sodium Injection, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (for 1 mL)
Microscope Objective	Mitutoyo	378-823-5	Model: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Camera	Hamamatsu		Model: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL (for 1 mL)
Zoom Stereo Microscope	Olympus		Model: SZ61, fluorescent microscope