En åpen fartøy-vindu tilnærming ved hjelp av fluorescerende tracers gir tilstrekkelig oppløsning for cochlear blodstrøm (CoBF) måling. Metoden letter studiet av strukturelle og funksjonelle endringer i CoBF i mus under normale og patologiske forhold.
Transduksjon av lyd er metabolsk krevende, og mikrovaskulaturens normale funksjon i sideveggen er avgjørende for å opprettholde endokokrometarpotensial, ionetransport og væskebalanse. Ulike former for hørselsforstyrrelser er rapportert å involvere unormal mikrosirkulasjon i sneglehuset. Undersøkelse av hvordan cochlear blodstrøm (CoBF) patologi påvirker hørselsfunksjonen er utfordrende på grunn av mangel på gjennomførbare avhørsmetoder og vanskeligheten med å få tilgang til det indre øret. Et åpent karvindu i den laterale sneglehusveggen, kombinert med fluorescens intravital mikroskopi, har blitt brukt til å studere CoBF-endringer in vivo, men mest hos marsvin og først nylig i musen. Dette papiret og tilhørende video beskriver den åpne fartøy-vindusmetoden for å visualisere blodstrømmen i musesneglehuset. Detaljer inkluderer 1) fremstilling av fluorescerende merket blodcellesuspensjon fra mus; 2) konstruksjon av et åpent fartøyvindu for intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling av blodstrømningshastighet og volum ved hjelp av et offline opptak av avbildningen. Metoden presenteres i videoformat for å vise hvordan man bruker åpen vindustilnærming i mus for å undersøke strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjon under normale og patologiske forhold.
Normal funksjon av mikrosirkulasjonen i den laterale cochleaveggen (som omfatter flertallet av kapillærene i spiralligamentet og stria vascularis) er kritisk viktig for å opprettholde hørselsfunksjon1. Unormal CoBF er involvert i patofysiologien til mange indre øreforstyrrelser, inkludert støyindusert hørselstap, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF vil muliggjøre en bedre forståelse av sammenhengen mellom hørselsfunksjon og cochlear vaskulær patologi.
Selv om kompleksiteten og plasseringen av sneglehuset i tinningbenet utelukker direkte visualisering og måling av CoBF, er det utviklet ulike metoder for vurdering av CoBF, inkludert laserdoppler-flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansavbildning (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspekkelkontrastavbildning (LSCI)16 , og tilnærminger basert på injeksjon av merkede markører og radioaktivt merkede mikrosfærer i blodet (optisk mikroangiografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av disse metodene har imidlertid aktivert absolutt sanntidssporing av endringer i CoBF in vivo, med unntak av FIVM. FIVM, i kombinasjon med et fartøyvindu i den laterale cochlearveggen, er en tilnærming som har blitt brukt og validert i marsvin under forskjellige eksperimentelle forhold av ulike laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metode ble vellykket etablert for å studere strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjonen i mus ved bruk av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran som kontrastmedium og et fluorescensfargestoff – enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, green) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red)-for forhåndsmerking av blodceller, visualisering av kar og sporing av blodstrømningshastighet. I denne studien er protokollen for denne metoden beskrevet for avbildning og kvantifisering av endringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (for eksempel etter støyeksponering). Denne teknikken gir forskeren verktøyene som trengs for å undersøke de underliggende mekanismene til CoBF relatert til hørselsdysfunksjon og patologi i stria vascularis, spesielt når de brukes sammen med lett tilgjengelige transgene musemodeller.
Dette papiret demonstrerer hvordan kapillærene i cochlear lateral veggen (og i stria vascularis) av en musemodell kan visualiseres med fluoroformerking i et åpent fartøy-vindu forberedelse under et FIVM-system. Musmodell er mye brukt og foretrukket som en pattedyrmodell for å undersøke menneskers helse og sykdom. Protokollen beskrevet her er en mulig tilnærming for avbildning og undersøkelse av CoBF i musens sidevegg (spesielt i stria vascularis) ved bruk av et åpent fartøyvindu under FIVM-system Metoden gir til…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) og Medical Research Foundation fra Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
PBS | Gibco | 2085387 | |
Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |