Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Summary

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) consente l’imaging selettivo e privo di etichette di specifiche moieties chimiche ed è stata efficacemente utilizzata per l’immagine di molecole lipidiche in vivo. Qui, forniamo una breve introduzione al principio della microscopia SRS e descriviamo i metodi per il suo uso nella conservazione lipidica di imaging in Caenorhabditis elegans.

Abstract

Il metabolismo lipidico è un processo fisiologico fondamentale necessario per la salute cellulare e dell’organismo. La disregolazione del metabolismo lipidico spesso provoca obesità e molte malattie associate tra cui disturbi cardiovascolari, diabete di tipo II e cancro. Per far progredire l’attuale comprensione della regolazione metabolica lipidica, i metodi quantitativi per misurare con precisione i livelli di conservazione lipidica in vivo nel tempo e nello spazio sono diventati sempre più importanti e utili. Gli approcci tradizionali per analizzare la conservazione lipidica sono semi-quantitativi per la valutazione microscopica o mancano di informazioni spazio-temporali per la misurazione biochimica. La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico senza etichette che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi nelle cellule vive con una risoluzione subcellulare. Poiché il contrasto è sfruttato dalle vibrazioni molecolari intrinseche, la microscopia SRS consente anche il tracciamento quadridimensionale dei lipidi negli animali vivi. Nell’ultimo decennio, la microscopia SRS è stata ampiamente utilizzata per l’imaging di piccole molecole nella ricerca biomedica e ha superato i principali limiti dei metodi convenzionali di colorazione fluorescente e di estrazione lipidica. In laboratorio, abbiamo combinato la microscopia SRS con gli strumenti genetici e biochimici a disposizione del potente organismo modello, Caenorhabditis elegans, per indagare la distribuzione e l’eterogeneità delle goccioline lipidiche tra diverse cellule e tessuti e, in ultima analisi, per scoprire nuove vie di segnalazione conservate che modulano il metabolismo lipidico. Qui, presentiamo i principi di lavoro e la configurazione dettagliata del microscopio SRS e forniamo metodi per il suo utilizzo nella quantificazione della conservazione lipidica in distinti punti di tempo di sviluppo di tipo selvaggio e insulina segnalando c. elegansmutanti carenti.

Introduction

L’obesità è diventata un problema di salute globale che minaccia un terzo della popolazione in tutto il mondo e presenta una seria preoccupazione medica, data la sua associazione con la cattiva^{salute mentale 1 e le} malattie mortali tra cui diabete², malattie^{cardiovascolari 3} e alcuni tipi di^{cancro 4}. Lo studio del metabolismo lipidico è essenziale per comprendere meglio i problemi biologici alla base dell’obesità. Una quantificazione rapida e specifica dell’immagazzinamento lipidico comporta l’individuazione degli acidi grassi e dei loro derivati, nonché dei metaboliti contenenti steroli, ad alta sensibilità e preferibilmente con informazioni spaziali. I lipidi sono obiettivi impegnativi da identificare perché mancano di fluorescenza intrinseca e non possono essere facilmente etichettati fluorescentmente. I tag fluorescenti sono spesso più grandi delle molecole lipidiche e, pertanto, possono essere chimicamente invasivi e impraticabili per applicazioni in vivo. La strategia di etichettatura senza etichette o minima è necessaria per preservare la struttura idrofobica delle molecole lipidiche⁵. I recenti sviluppi nelle tecnologie di imaging hanno creato interessanti opportunità per l’imaging senza etichette di lipidi in cellule viventi, tessuti e organismi.

Gli approcci tradizionali per le analisi di conservazione lipidica in campioni biologici includono saggi biochimici e protocolli di colorazione con coloranti lipofili. I test biochimici di quantificazione che coinvolgono la spettrometria di massa (SM) non hanno eguali nella loro risolvibilità molecolare, ma richiedono quantità di campioni molto grandi e la preparazione del campione di solito richiede diverse ore, limitando la loro applicazione per l’imaging in tempo reale dei sistemi^{viventi 5}. Un’altra importante limitazione di questi saggi è la mancanza di informazioni spaziali. D’altra parte, i coloranti lipofili come Oil Red O e Sudan Black forniscono la distribuzione tissutale e cellulare degli organelli di stoccaggio lipidico e rispetto alle tecniche MS, questi metodi di colorazione sono anche a basso costo e facili da eseguire. Tuttavia, questi protocolli di colorazione richiedono una fissazione, che può influire sulla natura idrofobica delle goccioline lipidiche, generare cambiamenti artificiali nella loro struttura e causare incongruenze tra gli^{esperimenti 6}. Le difficoltà tecniche associate alle tecniche biochimiche e di colorazione hanno portato alla ricerca di metodi senza etichette per l’immagine delle molecole lipidiche e al rapido aumento dell’uso di microscopia a dispersione Raman coerente (CRS) nell’imaging lipidico.

L’effetto Raman è stato riconosciuto per la prima volta da Raman e Krishnan, dove hanno riferito che dopo aver interagito con un fotone, una molecola può generare luce diffusa senza alcun cambiamento di lunghezza d’onda (chiamata scattering Rayleigh) o raramente con una lunghezza d’onda alterata (chiamata scattering Raman) e questo cambiamento di lunghezza d’onda è caratteristico dei gruppi chimici funzionali all’interno^{della molecola 7}. Quando i legami chimici all’interno di una molecola si eccitano ad un livello di energia vibrazionale più elevato da un fotone incidente, chiamato fotone della pompa, l’energia del fotone sparso, chiamato fotone di Stokes, diventa più bassa. Altrimenti, i legami chimici possono raggiungere un livello di energia vibrazionale inferiore se sono originariamente ad un livello superiore, e il fotone sparso guadagna energia per essere il fotone anti-Stokes. La differenza di frequenza tra l’incidente e i fotoni sparsi è nota come spostamento di Raman. Ogni legame chimico all’interno di una molecola ha uno spostamento raman caratteristico e quantificabile. Ad esempio, il legame CH₂ ha uno spostamento Raman di 2.845 cm^-1, che è abbondante nelle catene di acidi grassi⁸. Questo segnale Raman spontaneo è generalmente molto debole, il che ha ampiamente limitato la velocità di imaging nella microscopia spontanea raman convenzionale. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati vari approcci per aumentare la velocità di imaging e la sensibilità della microscopia spontanea Raman. La microscopia a dispersione Raman coerente, inclusa la microscopia cars (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) e la microscopia SRS (Stimulated Raman Scattering), è il progresso più recente. CARS e SRS hanno principi di lavoro leggermente diversi, ma entrambi sono tecniche senza etichette che hanno capacità di imaging dal vivo, possono fornire informazioni spaziali e temporali sulla dinamica di conservazione lipidica e richiedono solo piccole dimensioni del campione. La microscopia CARS soffre di background non risonante, che proviene da vari processi non lineari, e i segnali CARS hanno anche una relazione non lineare con la concentrazione della molecola, che insieme complicano il processo di^{quantificazione 9}. A differenza della microscopia CARS, la microscopia SRS non genera segnali di fondo non risonanti e offre una dipendenza lineare dalla concentrazione della molecola di interesse. Pertanto, attualmente la microscopia SRS è più ampiamente utilizzata per l’imaging lipidico.

Nella microscopia SRS, i deboli segnali spontanei Raman possono essere amplificati quando eccitati da due raggi laser sincronizzati con la loro differenza di frequenza corrispondente alla frequenza vibrazionale del legame chimico. La molecola sperimenterà una transizione migliorata verso uno stato eccitato a causa di un’eccitazione coerente. Di conseguenza, il tasso di generazione di fotoni Stokes viene aumentato. Di conseguenza, l’intensità del fascio “Stokes” trasmesso aumenta (guadagno raman stimolato, SRG) e l’intensità del fascio “pompa” trasmesso diminuisce (perdita raman stimolata, SRL). Il rilevamento dei segnali SRG o SRL è alla base dell’imaging della microscopia Stimulated Raman Scattering (SRS) di molecole con specifici legami chimici^10. Se la differenza di frequenza tra i due raggi laser non corrisponde alla frequenza vibrazionale del legame chimico all’interno di una molecola di interesse, non verranno generati né segnali SRG né SRL. La velocità di imaging della microscopia SRS è di circa 2 μsec per pixel o 1 secondo per fotogramma, che è molto più veloce della microscopia raman^{spontanea 11}. La risoluzione laterale tipica per la microscopia SRS è limitata alla diffrazione e a circa 300 nm. Inoltre, i processi ottici a due fotoni della microscopia SRS consentono l’imaging 3D volumetrico di campioni di tessuto spesso relativo e la profondità di imaging potrebbe raggiungere i 300-500 μm. Nel complesso, la microscopia SRS presenta una tecnica di imaging efficiente e priva di etichette per rilevare biomolecole specifiche, in particolare lipidi.

Le goccioline lipidiche sono organelli a membrana singola, che sono il principale sito di stoccaggio cellulare per lipidi neutri, compresi i triacilgilceroli (TAGs) e gli esteri del colesterolo (CE). I legami CH₂ nelle catene di acidi grassi di queste molecole lipidiche generano forti segnali SRS a 2.845 cm^{-1 quando} eccitati^8,consentendo così il rilevamento e la quantificazione dei livelli lipidici di stoccaggio in cellule intatte, sezioni tissutali e persino organismi^{interi 12,13,14,15}. In particolare, i C. elegans sono utili per gli studi di imaging lipidico grazie alla loro trasparenza. Come i mammiferi, anche i C. elegans immagazzinano lipidi nelle goccioline lipidiche e le vie di sintesi e degradazione delle molecole lipidiche sono altamente conservate¹⁶. In questo protocollo, forniremo il principio di funzionamento della microscopia SRS, la sua configurazione fondamentale e descriveremo i metodi per il suo utilizzo nell’imaging lipidico in C. elegans.

Protocol

1. Configurazione strumentale per microscopia a dispersione Raman stimolata NOTA: Il sistema di microscopia SRS è costruito su un laser a picosecondi con oscillatore parametrico ottico integrato della pompa e un microscopio a scansione laser confocale. L’oscillatore fornisce due treni a impulsi picosecondi, tra cui un fascio stokes a 1.064 nm e un fascio di pompaggio toniere tra 700-990 nm. La sovrapposizione temporale e spaziale dei due fasci si ottiene all’interno del laser. Un modulatore ele…

Representative Results

La segnalazione dell’insulina è un’importante via endocrina che influisce sullo sviluppo, la riproduzione, la durata della vita e il metabolismo. Nei vermi, la segnalazione dell’insulina consiste di circa 40 ligandi peptidici insulino-simili, ortologo del recettore del fattore di crescita insulino-simile DAF-2, cascata pi3K / AKT chinasi a valle e ortologo del fattore di trascrizione FoxO, DAF-1620. I mutanti daf-2, che mancano del recettore dell’insulina, hanno più goccioline lipidiche…

Discussion

In difesa contro l’obesità e i suoi disturbi metabolici associati, sono stati implementati importanti sforzi di ricerca per comprendere meglio i meccanismi regolatori dell’omeostasi lipidica. Per il rilevamento quantitativo di molecole lipidiche in campioni biologici, l’imaging senza etichette mediante microscopia SRS si è dimostrato un’alternativa affidabile ai saggi biochimici e ad altri metodi di colorazione. Il nostro gruppo e altri hanno rivelato nuovi meccanismi biologici nella regolazione metabolica lipidica com…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP