Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.
Abstract
Die technologischen Errungenschaften der Massenspektrometrie (MS) eröffnen viele unentdeckte Wege zur Analyse des globalen Proteoms eines Organismus unter unterschiedlichen Bedingungen. Diese kraftvolle Strategie, die auf die Wechselwirkungen von mikrobiellen Krankheitserregern mit dem gewünschten Wirt angewendet wird, charakterisiert beide Perspektiven auf Infektionen umfassend. Hierin beschreibt der Workflow die etikettenfreie Quantifizierung (LFQ) des Infektoms von Cryptococcus neoformans, einem pilzfakultativen intrazellulären Erreger, der der Erreger der tödlichen Krankheit Kryptokokkose ist, in Gegenwart von verewigten Makrophagenzellen. Das Protokoll beschreibt die geeigneten Proteinvorbereitungstechniken für Krankheitserreger und Säugetierzellen in einem einzigen Experiment, was zu einer angemessenen Peptid-Einreichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS-Analyse führt. Die hohe generische Natur des LFQ mit hohem Durchsatz ermöglicht eine breite Dynamik der Proteinidentifikation und -quantifizierung sowie die Übertragbarkeit auf jede Infektionseinstellung von Wirtspathogenen, wobei eine extreme Empfindlichkeit erhalten bleibt. Die Methode ist optimiert, um umfangreiche, unvoreingenommene Proteinreichtumsprofile eines Erregers unter infektionsimitleidenden Bedingungen zu katalogisieren. Insbesondere liefert die hier gezeigte Methode wesentliche Informationen zur Pathogenese von C. Neoformans, wie z. B. der für Virulenz notwendigen Proteinproduktion und identifiziert kritische Wirtsproteine, die auf eine mikrobielle Invasion reagieren.
Introduction
Die Prävalenz invasiver Pilzinfektionen nimmt enorm zu und korreliert mit unannehmbar hohen Sterblichkeitsraten, die am häufigsten bei Personen mit immundefiziden Veranlagungen berichtet werden1. Cryptococcus neoformans ist ein berüchtigter opportunistischer Pilzerreger, der in der Lage ist, intrazelluläre sesäichliche Überleben innerhalb von Wirtsmakrophagenzellen zu überleben. Unzureichende antimykotische Intervention führt zu Pilzverbreitung und lebensbedrohliche Manifestationen von kryptokokkaler Meningitis und Meningoenzephalitis2,3. Die globale Zunahme des immungeschwächten Status hat eine parallele Zunahme der Verwendung von Antimykotika gefordert, in denen viele Pilzarten, einschließlich C. Neoformans, zunehmend Resistenzen gegen4,5,6entwickelt haben. Daher ist es unerlässlich, robuste und effiziente Technologien zu implementieren, um lebenswichtige biologische Fragen in Bezug auf die Reaktion auf die Wirtsabwehr und die mikrobielle Pathogenese zu beantworten.
Das neue Zeitalter des technologischen Fortschritts in der Massenspektrometrie (MS), einschließlich der Erzeugung leistungsfähiger computergestützter und bioinformatischer Pipelines, bildet die Grundlage für eine integrative Vision für eine groß angelegte Analyse der Wirtspathogenforschung7,8. Herkömmliche pathogenese-gesteuerte proteomische Analysen profilieren häufig die Sicht der Infektion entweder aus der Perspektive des Wirts oder des Krankheitserregers, einschließlich umfassender Methoden wie Proteinkorrelationsprofilierung, Affinitätschromatographie in Kombination mit Proteomik und Interkomik9. Untersuchungen zur Virulenz gefährlicher Krankheitserreger in einem Wirtssystem sind von immenser klinischer Bedeutung; Die Anwendung einer dualen Perspektivanalyse in einem einzigen Experiment galt jedoch früher als unerreichbar. Zum Beispiel wird die Perspektive des Erregers auf eine Infektion oft von reichlich reichlich vorhandenen Wirtsproteinen überwältigt, was zu einer verringerten Empfindlichkeit für den Nachweis von schwach vorhandenen Pilzproteinenführt 7. Darüber hinaus lädt die hohe Probenkomplexität viele Ziele ein, in einem einzigen experimentellen System zu untersuchen, und erweist sich als schwierig, Wirkmechanismen für ein bestimmtes Pathogenprotein aufzuklären.
Bottom-up-Proteomik ist eine beliebte MS-Technik, die eine überschaubare Probenvorbereitung ermöglicht, bei der Peptide durch sequenzspezifische enzymatische Verdauung erzeugt werden, gefolgt von Flüssigkeitschromatographie-Trennung, Identifizierung und Quantifizierung durch MS10,11. Hier stellen wir eine Methode vor, die eine datenabhängige Erfassungsstrategie demonstriert, die darauf ausgerichtet ist, eine unvoreingenommene Abdeckung eines infektionsbasierten Proteoms oder “Infektoms” zu erreichen. Insbesondere die etikettenfreie Quantifizierung (LFQ) verringert die Abhängigkeit von chemischen oder metabolischen Etiketten für eine robuste und genaue Identifizierung von Proteinstandsänderungen über mehrere Proteome hinweg, wodurch die Probenhandhabung und die Verarbeitungsschritte12,13reduziert werden. Diese universelle Anwendung fragt produzierte Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle unabhängig von der erwarteten Proteinproduktion ab; So können neue Erkenntnisse entdeckt werden, die für eine Infektion entscheidend sind.
Der hier beschriebene Workflow ist optimiert, um Veränderungen des Proteinspiegels von C. Neoformanen während der Infektions-Mimikking-Bedingungen mit Wirtsimmunzellen zu untersuchen (Abbildung 1). Anstatt sich auf die Isolierung und Trennung von Zelltypen zu verlassen, extrahiert dieser Ansatz das Wirts- und Erregerproteom zusammen und nutzt die bioinfordische Trennung mithilfe von zwei organismusspezifischen Datenbanken, um die artspezifische Proteinproduktion zu unterscheiden. Diese Methode bietet Vorteile für eine unbegrenzte Anzahl von Proben, die ohne die zusätzlichen kostspieligen Vorbereitungsschritte verarbeitet werden, die in isotopenbasierten Etikettierungsstudien oder Fraktionen erforderlich sind. Darüber hinaus unterstützt dieser Workflow optimierte Proteinextraktionsprotokolle, die auf eine Breite von Pilz- und Bakterienerregern übertragbar sind, die in der Lage sind, Wirtsimmunzellen anzusprechen und zu infizieren. Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schritte zur Durchführung einer unvoreingenommenen Proteinextraktion und Probenverarbeitung für hochauflösende MS, gefolgt von Daten und statistischen Analysen, die in der Lage sind, eine Fülle von Kenntnissen über Pilzproteine bereitzustellen, die für eine Infektion wichtig sind, kombiniert mit einer umfassenden Profilierung der Host-Abwehrreaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Vorbereitung von Makrophagenzellen und die Entnahme von Co-Kulturproben für die Proteinverarbeitung mit minimaler Unterbrechung der Zellen. Es ist wichtig, Schritte des Waschens, Impfens und Entfernens von anhaftenden Makrophagenzellen sanft und sorgfältig durchzuführen, um unnötige Lyse von Zellen vor der Entnahme zu verhindern. Die Festlegung des richtigen MOI für das Experiment ist auch entscheidend, da die Impfung mit einem zu hohen MOI zu einem schnellen T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jonathan Krieger von Bioinformatics Solutions Inc. für den Betrieb des Massenspektrometers für repräsentative Experimente sowie Mitgliedern der Geddes-McAlister-Gruppe für ihre Unterstützung bei der experimentellen Einrichtung und dem Manuskript-Feedback. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung, teilweise von der Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425) und der Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) für J.G.M., sowie dem NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B.
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
