ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配
Summary
我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。
Abstract
ファブレット サーモビア家畜は 、地球上で成功した進化放射線につながった昆虫の発達メカニズムを研究するのに適した代謝された翼のない種です。ゲノム編集などの遺伝的ツールの応用は、Evo-Devoアプローチにおける進化的移行を担う遺伝的変化を理解する鍵です。この記事では 、T.家産の変異株を生成し、維持するための現在のプロトコルについて説明します。我々は、報告された湿式注入法の代替として、注入された胚において安定的に高い生存率を得ることを可能にする乾燥注入方法を報告する。また、成人との交尾を行い、その後の世代を高効率で取得するための最適化された環境設定を報告します。我々の方法は、非伝統的なモデル生物にゲノム編集方法をうまく適用するために、種固有の生物学を考慮に入れる重要性を強調している。これらのゲノム編集プロトコルは 、T.家畜 を実験室モデルとして実施し、この種における有用な遺伝ツールの開発と応用をさらに加速させるのに役立つと予測しています。
Introduction
熱藻家畜は、最も基礎的な昆虫の注文の1つに属しています, Zygentoma, 先祖の代謝と翼のないライフサイクルを保持します.このような基底系統的位置と先祖の特徴は、この種を地球上の昆虫の成功の基礎となるメカニズムを研究するための魅力的なモデルとして設定し、記述された動物種の70%以上をカバーする1。T. 家産は、比較的短いライフサイクル(胚から生殖成人までの2.5~3.0ヶ月)などの実験室モデルとして適した特徴があるため、主に昆虫生理学の祖先特性を研究するために主に使用されてきました。図 1A)そして簡単な繁殖。過去30年間で、ボディプラン、神経分化、概日リズム2、3、4などの様々な形質の祖先の特徴を調査するために、その使用が拡大されました。
T.家産における高度な遺伝ツールの適用は、広い研究分野におけるこのような貢献をさらに加速させる可能性がある。胚、ニンフ、および成人におけるRNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウンがT.家畜4、5、6で報告されている。全身RNAiの効率は依然として種に依存性が高く、例えば、コレオプテラでは一般的に高いが、鱗翅目の順序は7.T.ドメダナのRNAiノックダウンの効率と持続時間はまだ評価されていません。RNAiに加えて、我々は以前にT.家産8で成功したCRISPR /Cas9媒介遺伝子ノックアウトを報告しました。CRISPR/Casシステムは、特に標的遺伝子ノックアウトの昆虫のゲノム編集に広く応用されています。その使用は、CRISPR/Casシステムの成分を核9に送達するためのプロトコルの確立後に、遺伝子レポーターアッセイ、細胞系譜追跡、およびノッキングイン外因性構造による転写活性の操作などの他の用途に拡大することができる。公表されたゲノムアセンブリ10と組み合わせることで、T.家畜におけるCRISPR/Casベースのゲノム編集の広い使用とさらなる発展は、昆虫の顕著な適応成功の背後にある進化メカニズムに焦点を当てた研究を容易にするだろう。ここでは、胚微小注入とCRISPR/Cas9を用いて変異株を生成する成人T.家産を交配するための詳細なプロトコルについて説明する。この新しい方法を考えると、我々はこれらの技術の成功した応用のための非伝統的なモデル種の独特な生物学を考慮することの重要性を議論する。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9を用いた所望の T.家畜 変異体の生成に成功するためには、注射のために十分な数の段階的胚を収集することが最初に重要である。十分な数の T.家畜 卵の一定のコレクションの場合、重要なのは、すべての成体モルト13の後に繰り返される一連の複雑な交配行動の正常な完了を助けるので、より低い人口密度を有する容器の適切なサイズを選択すること?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TO と TD はそれぞれ、JSPS KAKENHI 認可番号 19H02970 と 20H02999 によってサポートされました。
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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