Eggmikroinjeksjon og effektiv parring for genomredigering i Firebrat Thermobia domestica
Summary
Vi tilbyr en detaljert protokoll for oppdrett, mikroinjeksjon av egg og for effektiv parring av ildbremsen Thermobia domestica for å generere og opprettholde muterte stammer etter genomredigering.
Abstract
Den ildbremse Thermobia domestica er en ametabolous, vingeløs art som er egnet for å studere utviklingsmekanismer av insekter som førte til deres vellykkede evolusjonære stråling på jorden. Anvendelsen av genetiske verktøy som genomredigering er nøkkelen til å forstå genetiske endringer som er ansvarlige for evolusjonære overganger i en Evo-Devo-tilnærming. I denne artikkelen beskriver vi vår nåværende protokoll for å generere og opprettholde muterte stammer av T. domestica. Vi rapporterer en tørr injeksjonsmetode, som et alternativ til den rapporterte våte injeksjonsmetoden, som gjør at vi kan oppnå stabilt høye overlevelsesrater hos injiserte embryoer. Vi rapporterer også en optimalisert miljøinnstilling for å parre voksne og oppnå etterfølgende generasjoner med høy effektivitet. Vår metode understreker viktigheten av å ta hensyn til hver arts unike biologi for vellykket anvendelse av genomredigeringsmetoder til ikke-tradisjonelle modellorganismer. Vi spår at disse genomredigeringsprotokollene vil bidra til å implementere T. domestica som laboratoriemodell og å ytterligere akselerere utviklingen og anvendelsen av nyttige genetiske verktøy i denne arten.
Introduction
Thermobia domestica tilhører en av de mest basale insektordrene, Zygentoma, som beholder en forfedres ametaboløse og vingeløse livssyklus. Slike basale fylogenetiske posisjon og forfedres egenskaper setter denne arten som en attraktiv modell for å studere mekanismene som ligger til grunn for suksessen til insekter på jorden, som dekker over 70% av de beskrevnedyreartene 1. T. domestica har lenge vært brukt hovedsakelig til å studere forfedrenes egenskaper av insektfysiologi på grunn av egnede egenskaper som laboratoriemodell, for eksempel en relativt kort livssyklus (2,5-3,0 måneder fra embryo til reproduktiv voksen; Figur 1A) og en enkel avl. I de siste tre tiårene har bruken blitt utvidet til å undersøke forfedrenes egenskaper av ulike egenskaper som kroppsplan, nevrale differensiering og døgnrytme2,3,4.
Anvendelsen av avanserte genetiske verktøy i T. domestica kan ytterligere akselerere slike bidrag i et bredt forskningsområde. Vellykket RNA interferens (RNAi)-mediert gen knockdown i embryoer, nymfer, og voksne har blitt rapportert i T. domestica4,5,6. Effektiviteten av systemisk RNAi er fortsatt svært artsavhengig- for eksempel er den generelt høy i coleoptera, mens den er lav i lepidoptera-rekkefølgen7. Effektiviteten og varigheten av RNAi-knockdown i T. domestica er ennå ikke vurdert. I tillegg til RNAi har vi tidligere rapportert en vellykket CRISPR/Cas9-mediert gennedslag i T. domestica8. CRISPR/Cas-systemet har blitt mye brukt på genomredigering i insekter, spesielt for målrettet gennedslag. Bruken kan utvides for andre applikasjoner som genreporteranalyse, sporing av celler og manipulering av transkripsjonsaktivitet ved å banke inn eksogene konstruksjoner etter etableringen av en protokoll for levering av komponenter i CRISPR/Cas-systemet ikjerner 9. Kombinert med den publisertegenomsamlingen 10,vil den brede bruken og videreutviklingen av CRISPR/ Cas-basert genomredigering i T. domestica legge til rette for studier med fokus på de evolusjonære mekanismene bak den enestående adaptive suksessen til insekter. Her beskriver vi en detaljert protokoll for embryomikroinjeksjon og for parring av voksen T. domestica for å generere en mutert stamme ved hjelp av CRISPR/Cas9. Med tanke på denne nye metoden diskuterer vi viktigheten av å vurdere den unike biologien til ikke-tradisjonelle modellarter for vellykkede anvendelser av disse teknikkene.
Protocol
Representative Results
Discussion
For den vellykkede generasjonen av ønsket T. domestica mutant med CRISPR/Cas9, er det først viktig å samle et tilstrekkelig antall iscenesatte embryoer til injeksjon. For en konstant samling av et tilstrekkelig antall T. domestica egg, er nøkkelen å velge en passende størrelse på beholderen for å ha en lavere befolkningstetthet fordi det ville hjelpe vellykket gjennomføring av en rekke komplekse parring atferd, som gjentas etter hver voksen smeltet13. En mannlig T. d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TIL og TD ble støttet av JSPS KAKENHI tilskuddsnumre 19H02970 og 20H02999, henholdsvis.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. . Insect Hormones. , (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
