Denne artikel præsenterer en metode til at generere protein krystaller derivatized med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre) ved hjælp af mikroseeding at generere nye krystallisering betingelser i sparsomme matrix skærme. Bakkerne kan sættes op ved hjælp af flydende dispenserrobotter eller i hånden.
Protein struktur belysning ved hjælp af røntgenkrystallografi kræver både høj kvalitet diffracting krystaller og beregningsmæssige løsning af diffraktion fase problem. Nye strukturer, der mangler en passende homologi model er ofte derivatized med tunge atomer til at give eksperimentelle fase oplysninger. Den præsenterede protokol genererer effektivt derivatized protein krystaller ved at kombinere tilfældige microseeding matrix screening med derivatization med en tung atom molekyle I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre). Ved at indarbejde I3C i krystalgitteret kan diffraktionsfaseproblemet løses effektivt ved hjælp af en enkelt bølgelængdesynomenspredning (SAD) udfasning. Den ligesidede trekant arrangement af jodatomer i I3C giver mulighed for hurtig validering af en korrekt unormal underkonstruktion. Denne protokol vil være nyttig for strukturelle biologer, der løser makromolekylære strukturer ved hjælp af krystallografi-baserede teknikker med interesse i eksperimentel udfasning.
Inden for strukturel biologi betragtes røntgenkrystallografi som guldstandardteknikken til bestemmelse af makromolekylers atomare opløsningsstrukturer. Det er blevet udnyttet i udstrakt grad at forstå det molekylære grundlag af sygdomme, guide rationelmedicin design projekter og belyse den katalytiske mekanisme af enzymer1,2. Selv om strukturelle data giver et væld af viden, processen med proteinudtryk og rensning, krystallisering og struktur bestemmelse kan være yderst besværligt. Der opstår ofte flere flaskehalse, som hindrer disse projekters fremskridt, og dette skal rettes for effektivt at strømline rørledningen til bestemmelse af krystalstrukturen.
Efter rekombinant udtryk og rensning, indledende betingelser, der er befordrende for krystallisering skal identificeres, som ofte er en vanskelig og tidskrævende aspekt af røntgenkrystallografi. Kommercielle sparsomme matrixskærme , der konsoliderer kendte og offentliggjorte betingelser , er blevet udviklet for at afhjælpe denneflaskehals 3,4. Men, Det er almindeligt at generere få hits fra disse indledende skærme på trods af at bruge meget ren og koncentreret protein prøver. Observation af klare dråber indikerer, at proteinet ikke kan nå de niveauer af overmætning, der kræves for at kerne en krystal. For at fremme krystalkernering og vækst kan frø fremstillet af allerede eksisterende krystaller tilsættes til betingelserne, og dette giver mulighed for øget prøveudtagning af krystalliseringsrummet. Ireton og Stoddard introducerede først mikroseed matrixscreeningsmetoden5. Krystaller af dårlig kvalitet blev knust for at lave en frøbestand og tilsættes derefter systematisk til krystalliseringsforhold, der indeholdt forskellige salte, for at generere nye krystaller af diffraktionskvalitet, som ellers ikke ville have dannet. Denne teknik blev yderligere forbedret af D’Arcy et al. der udviklede tilfældige mikroseed matrix screening (rMMS), hvor frø blev indført i en ekstra matrix krystallisering skærm6,7. Dette forbedrede kvaliteten af krystaller og øgede antallet af krystallisering hits i gennemsnit med en faktor på 7.
Efter krystaller er produceret med succes, og en X-ray diffraktion mønster er opnået, en anden flaskehals i form af at løse ‘fase problem’ er stødt på. Under dataindsamlingsprocessen registreres diffraktionsintensiteten (proportional med amplitudens kvadrat), men faseoplysningerne går tabt, hvilket giver anledning til det faseproblem, der standser bestemmelsen om øjeblikkeligstruktur 8. Hvis målproteinet deler høj sekvensidentitet med et protein med en tidligere bestemt struktur, kan molekylær udskiftning bruges til at anslåfaseinformationen 9,10,11,12. Selvom denne metode er hurtig og billig, er modelstrukturerne muligvis ikke tilgængelige eller egnede. Succesen med homologi model-baserede molekylære udskiftning metode falder betydeligt som sekvens identitet falder til under 35%13. I mangel af en passende homologi model, ab initio metoder, såsom ARCIMBOLDO14,15 og RIGELIG16, kan testes. Disse metoder bruger beregningsmæssigt forudsagte modeller eller fragmenter som udgangspunkt for molekylær udskiftning. RIGELIG, som bruger forudsagt lokkedue modeller som udgangspunkt, kæmper for at løse strukturer af store (> 100 rester) proteiner og proteiner, der indeholder overvejende β-ark. ARCIMBOLDO, som forsøger at montere små fragmenter til at udvide til en større struktur, er begrænset til data med høj opløsning (≤2 Å) og af algoritmernes evne til at udvide fragmenterne til en fuld struktur.
Hvis molekylær udskiftningsmetoder mislykkes, skal der anvendes direkte metoder som isomorf udskiftning17,18 og unormal spredning ved en enkelt bølgelængde (SAD19) eller flere bølgelængder (MAD20). Dette er ofte tilfældet for virkelig nye strukturer, hvor krystal skal dannes eller derivatized med en tung atom. Dette kan opnås ved iblødsætning eller co-krystalliserende med en tung atomforbindelse, kemisk modifikation (såsom 5-bromouracil inkorporering i RNA) eller mærket protein udtryk (såsom indarbejde selenomethionin eller selenocystein aminosyrer i den primære struktur)21,22. Dette komplicerer krystalliseringsprocessen yderligere og kræver yderligere screening og optimering.
En ny klasse af udfasning forbindelser, herunder I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syre) og B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic syre), tilbyder spændende fordele i forhold til allerede eksisterende udfasning forbindelser23,24,25. Både I3C og B3C har et aromatisk ringstillads med et vekslende arrangement af unormale scatters, der kræves til direkte udfasningsmetoder og amino- eller carboxylate funktionelle grupper, der interagerer specifikt med proteinet og giver bindende stedspec specificitet. Det efterfølgende ligesidede trekantede arrangement af tungmetalgrupper giver mulighed for en forenklet validering af den indfasningsmæssige underkonstruktion. I skrivende stund er der 26 I3C-bundne strukturer i Protein Data Bank (FBF), hvoraf 20 blev løst ved hjælp af SAD-udfasning26.
Denne protokol forbedrer effektiviteten af strukturen bestemmelse rørledningen ved at kombinere metoderne til tungmetal derivatization og rMMS screening til samtidig at øge antallet af krystallisering hits og forenkle krystal derivatisering proces. Vi viste denne metode var yderst effektiv med høne æggehvide lysozym og et domæne af en roman lysin protein fra bakteriofage P6827. Struktur løsning ved hjælp af den højt automatiserede Auto-Rickshaw struktur bestemmelse pipeline er beskrevet, specielt skræddersyet til I3C udfasning sammensatte. Der findes andre automatiserede rørledninger , der kan bruges , såsom AutoSol28, ELVES29 og CRANK230. Ikke-fuldautomatiske pakker som SHELXC/D/E kan også bruges31,32,33. Denne metode er især til gavn for forskere, der studerer proteiner mangler homologe modeller i FBF, ved at reducere antallet af screening og optimering trin. En forudsætning for denne metode er proteinkrystaller eller et krystallinsk bundfald af målproteinet, fremstillet af tidligere krystalliseringsforsøg.
Strukturbestemmelse af et nyt protein i mangel af en egnet homologimodel til molekylær udskiftning kræver eksperimentel udfasning. Disse metoder kræver inkorporering af tunge atomer i proteinkrystallen, hvilket tilføjer en grad af kompleksitet til konstruktionsbestemmelsesrørledningen og kan indføre mange forhindringer, der skal løses. Tunge atomer kan inkorporeres direkte i proteinet ved hjælp af mærket udtryk ved hjælp af selenomethionin og selenocystein. Da denne metode er dyr, besværlig og kan resultere i lavere proteinudbytter, udtrykkes mærket protein ofte efter krystalliseringsbetingelser er blevet fundet og optimeret med umærket protein. Alternativt kan krystaller afaktiveres ved iblødsætning i en opløsning, der indeholder tunge atomer22,63,64. Denne metode bruger ofte krystaller af høj kvalitet og udføres derfor efter en robust krystalliseringsmetode er allerede udviklet. Held opnå en derivatized krystal ved hjælp af denne metode kræver yderligere optimering af iblødsætning procedurer og screening af forskellige udfasning forbindelser, derfor tilføje mere tid til en allerede besværlig proces.
Co-krystallisering af proteinet med det tunge atom kan udføres på screeningsstadiet, hvilket effektivt strømliner processen og reducerer krystalmanipulationstrin, der kan forårsage skade. Men der stadig eksisterer det potentielle scenario for at opnå nogle indledende krystallisering hits og problemet med at vælge en kompatibel tung atomforbindelse. Mange i øjeblikket tilgængelige udfasning forbindelser er uforenelige med udfældende stoffer, buffere og tilsætningsstoffer, der almindeligvis findes i krystallisering betingelser. De kan være uopløselige i sulfat- og fosfatbuffer, chelat til citrat og acetat, reagere negativt med HEPES- og Tris-buffere eller blive afsondret af DTT og β-mercaptoethanol21. Da I3C udfasning sammensatte ikke lider af disse uoverensstemmelser, Det er en robust udfasning sammensatte, der kunne være modtagelige for mange forskellige betingelser.
I denne undersøgelse præsenteres en strømlinet metode til fremstilling af derivatiserede krystaller, der er klar til SAD-udfasning gennem samtidig co-krystallisering af I3C-udfasningsstoffet og rMMS. Kombinationen af begge teknikker øger antallet af krystallisering hits, med mange af de betingelser, der har forbedret morfologi og diffraktion egenskaber. I både Orf11 NTD- og HEWL-testtilfælde blev der identificeret nye forhold på I3C-rMMS-skærmen, som ikke var til stede, da I3C ikke var til stede. Potentielt kan I3C binde sig positivt til proteinet, hvilket letter dannelsen og stabiliseringen af krystalkontakter27. Til gengæld kan dette fremkalde krystallisering og muligvis forbedre diffraktion egenskaber. Udover at være en forbindelse kompatibel med sparsomme matrix skærme, I3C er også en attraktiv udfasning sammensatte på grund af dens iboende egenskaber. De funktionelle grupper, der veksler med jod på det aromatiske ringstillads, tillader specifik binding til proteiner. Dette fører til større belægning og reducerer potentielt baggrundssignal23. Desuden er placeringen af unormale spredere i en ligesidet trekant indlysende i understrukturen og kan bruges til hurtigt at validere binding af I3C (Figur 4B og 4C). Endelig kan det producere en unormal signal med tunable synkrotron stråling samt krom og kobber roterende anode røntgenkilder. Det kan således anvendes på mange forskellige arbejdsgange. Da I3C er bredt tilgængelige og billigt at købe, er denne fremgangsmåde inden for rækkevidde for de fleste strukturelle biologilaboratorier.
Der er flere eksperimentelle overvejelser, der skal behandles, når du bruger I3C-rMMS-metoden. Denne metode kan ikke anvendes, hvis der ikke kan opnås det første krystallinske materiale af proteinet. I vanskelige tilfælde kan krystallinsk materiale fra et homologt protein også bruges til at generere frøbestand. Denne krydssåningstilgang til rMMS har vist nogle lovende resultater7. Optimering krystal nummer gennem fortynding af frø bestanden er et afgørende skridt, som ikke bør overses, for at maksimere chancen for at producere høj kvalitet store krystaller og erhverve passende diffraktion data. Hvis der kun er identificeret få I3C-steder i den asymmetriske enhed, bør de betingelser, der fremmer krystallisering, optimeres yderligere med en øget koncentration af I3C. Dette kan øge belægningen af I3C for at maksimere det unormale signal og støtte krystal derivatization.
Der kan være tilfælde, hvor denne teknik ikke kan være den optimale metode til at derivatize protein krystaller. Efterhånden som størrelsen af et protein- eller proteinkompleks stiger, giver det begrænsede antal I3C-steder på proteinoverfladen muligvis ikke tilstrækkelig udfasningskraft til at løse strukturen. I disse scenarier, hvor proteinstørrelse mistænkes for at hindre udfasning, kan selenomethioninmærkning af proteinet være en mere holdbar tilgang til udfasning af proteinet. Hvis proteinet har et tilstrækkeligt antal methioninrester i proteinet (anbefales at have mindst én methionin pr. 100restkoncentrationer 65), og der kan opnås højeffektiv selenomethioninindblanding i et protein (f.eks. i bakterielle ekspressionssystemer66), vil der være flere højindstykningssuktomer til stede i krystallerne for at fase strukturen.
Desuden kan nogle proteiner i sagens natur være uegnet til derivatisering med I3C. I3C-bindingssteder for proteiner er afhængige af proteinstruktur. Der kan findes proteiner, der naturligt har få eksponerede plastre, der er kompatible med I3C-binding. Det er således ikke uforudsigeligt, at der kan være problemer med at co-krystallisere nogle målproteiner med I3C.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev foretaget på MX1 beamline på den australske Synchrotron, en del af ANSTO. Forfatterne vil gerne anerkende medlemmer af Shearwin og Bruning laboratorier for drøftelser om dette arbejde. Forfatterne vil også gerne anerkende Dr. Santosh Panjikar og Dr. Linda Whyatt-Shearwin, der bidrog til det oprindelige arbejde, der banebrydende denne protokol.
Følgende finansiering er anerkendt: Australian Research Council (tilskud nr. DP150103009 og DP160101450 til Keith E. Shearwin); University of Adelaide (australian government research training program stipendium til Jia Quyen Truong og Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |