本稿では、マイクロシードを用いてI3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)で誘導体化したタンパク質結晶を生成し、まばらなマトリックススクリーンで新しい結晶化条件を生成する方法を紹介します。トレイは液体分配ロボットを使用して、または手で設定することができます。
X線結晶学を用いたタンパク質構造解明は、高品質の回折結晶と回折相問題の計算溶液の両方を必要とする。適切な相同性モデルを欠く新しい構造は、しばしば重原子で誘導され、実験段階情報を提供する。提示されたプロトコルは、ランダムマイクロ播種マトリックススクリーニングと重原子分子I3C(5-アミノ2,4,6-トリヨードイソフタル酸)と誘導体化を組み合わせることにより、誘導体化タンパク質結晶を効率的に生成します。I3Cを結晶格子に組み込むことで、単一波長の変性分散(SAD)フェスを用いて回折相問題を効率的に解決できる。I3Cにおけるヨウ素原子の正三角形配置により、正しい異常な部分構造を迅速に検証することができます。このプロトコルは、実験的なフェスに興味を持って結晶学ベースの技術を用いて高分子構造を解く構造生物学者にとって有用であろう。
構造生物学の分野では、X線結晶学は、高分子の原子分解能構造を決定するゴールドスタンダード技術と見なされています。疾患の分子基盤を理解し、合理的な薬剤設計プロジェクトを導き、酵素1,2の触媒機構を解明するために広く利用されている。構造データは豊富な知識を提供しますが、タンパク質の発現と精製、結晶化、構造決定のプロセスは非常に面倒です。これらのプロジェクトの進行を妨げるボトルネックがいくつか発生することが多く、結晶構造決定パイプラインを効率的に合理化するために対処する必要があります。
組み換え式と精製の後、結晶化を助長する予備的な条件を特定する必要があり、これはしばしばX線結晶学の困難で時間のかかる側面である。既知の条件と公開された条件を統合する商用のまばらな行列画面は、このボトルネックを緩和するために開発されています3,4.しかし、非常に純粋で濃縮されたタンパク質サンプルを使用しているにもかかわらず、これらの初期スクリーンから少数のヒットを生成することが一般的です。透明な滴を観察することは、タンパク質が結晶を核生成するために必要な過飽和レベルに達していない可能性があることを示しています。結晶の核化と成長を促進するために、既存の結晶から生成された種子を条件に加えることができ、これは結晶化空間のサンプリングを増加させることができます。アイルトンとストッダードは、最初にマイクロシードマトリックススクリーニング方法5を導入しました。質の悪い結晶を粉砕して種子ストックを作り、異なる塩を含む結晶化条件に体系的に添加し、他の方法では形成されなかった新しい回折品質の結晶を生成しました。この技術は、予備のマトリックス結晶化スクリーン6,7に種子を導入したランダムマイクロシードマトリックススクリーニング(rMMS)を開発したD’Arcyらによってさらに改善された。これにより、結晶の品質が向上し、平均して結晶化ヒット数が7倍増加しました。
結晶が正常に生成され、X線回折パターンが得られた後、「位相問題」を解決する形で別のボトルネックが発生します。データ取得処理の間、回折の強度(振幅の二乗に比例)が記録されるが、位相情報が失われ、直ちに構造判定8を停止する位相問題を生じる。標的タンパク質が以前に決定された構造を有するタンパク質に高い配列同一性を共有する場合、分子置換を用いて相情報9、10、11、12を推定することができる。この方法は高速で安価ですが、モデル構造は利用できないか、または適切でない場合があります。相同性モデルベースの分子置換法の成功は、配列同一性が35%13を下回るにつれて大幅に低下する。適切な相同性モデルがない場合、AB initioメソッド、例えばARCIMBOLDO14、15およびAMPLE16、試験することができる。これらの方法は、分子置換の出発点として計算予測モデルまたはフラグメントを使用します。予測されたおとりモデルを出発点として使用するAMPLEは、主にβシートを含む大規模な(>100残基)タンパク質およびタンパク質の構造を解決するのに苦労しています。より大きな構造に拡張するために小さな断片を収めようとするARCIMBOLDOは、高解像度データ(≤2 Å)と、アルゴリズムがフラグメントを完全な構造に拡張する能力に限定されます。
分子置換法が失敗した場合、単一波長(SAD19)または複数波長(MAD20)における同型置換17、18および異常散乱などの直接的な方法を用いる必要がある。これは、結晶を形成または重い原子で誘導しなければならない本当に新しい構造のためにしばしば当てはまりません。これは、重原子化合物と共結晶化したり、化学修飾(RNAに5-ブロモウラシルを組み込むなど)または標識タンパク質発現(セレノメチオニンまたはセレノシステインアミノ酸を一次構造に組み込むなど)21,22に浸すことによって達成できる。これはさらに結晶化プロセスを複雑にし、追加のスクリーニングと最適化を必要とします。
I3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)およびB3C(5-アミノ-2,4,6-トリブロマイソフタル酸)を含む新しいクラスのフェージング化合物は、既存のフェージング化合物23、24、25よりもエキサイティングな利点を提供します。I3CとB3Cの両方は、タンパク質と特異的に相互作用し、結合部位特異性を提供する直接フェース法およびアミノまたはカルボキシレート官能基に必要な異常散乱の交互配置を有する芳香環足場を特徴とする。重金属基のその後の正三角形配置により、フェス構造の検証が簡単になります。執筆時点では、タンパク質データバンク(PDB)には26のI3C結合構造があり、そのうち20個はSADフェス処理26を使用して解決された。
このプロトコルは、重金属誘導体化とrMMSスクリーニングの方法を組み合わせて、同時に結晶化ヒットの数を増やし、結晶誘導体化プロセスを簡素化することによって、構造決定パイプラインの有効性を向上させます。我々は、この方法が、鶏卵白リソザイムおよびバクテリオファージP6827からの新規リジンタンパク質のドメインと非常に効果的であることを実証した。高度に自動化された自動人力車構造決定パイプラインを用いた構造溶液が記載され、具体的にはI3Cフェス化合物に合わせた。オートソル28、ELVES29 、および CRANK230など、他の自動化されたパイプラインが存在します。SHELXC/D/E などの完全に自動化されていないパッケージも31、32、33を使用できます。この方法は、PDBで相同モデルを欠くタンパク質を研究している研究者にとって特に有益であり、スクリーニングおよび最適化のステップの数を大幅に減らすことによって有用である。この方法の前提条件は、タンパク質結晶または標的タンパク質の結晶性沈殿であり、以前の結晶化試験から得られる。
分子置換のための適切な相同性モデルがない場合の新規タンパク質の構造決定には、実験的なフェスを必要とする。これらの方法は、構造決定パイプラインに複雑さのレベルを追加し、対処しなければならない多くの障害を導入することができるタンパク質結晶に重原子を組み込む必要があります。重原子は、セレノメチオニンおよびセレノシステインを用いた標識発現を介してタンパク質に直接組み込むことができる。この方法は高価であり、手間がかかり、より低いタンパク質収率をもたらし得る、標識されたタンパク質は、結晶化条件が発見され、標識されていないタンパク質で最適化された後にしばしば発現される。あるいは、結晶は、重原子22、63、64を含む溶液に浸すことによって誘導体化することができる。この方法は、多くの場合、高品質の結晶を使用し、堅牢な結晶化方法が既に開発された後に行われます。この方法を用いて誘導体化結晶を得るためには、浸漬手順のさらなる最適化と異なるフェス化合物のスクリーニングが必要であり、すでに面倒なプロセスに時間を追加します。
重原子とタンパク質の共結晶化は、スクリーニング段階で行うことができるので、プロセスを効率的に合理化し、損傷を引き起こす可能性のある結晶操作ステップを低減することができます。しかし、まだいくつかの初期結晶ヒットを得る潜在的なシナリオと互換性のある重原子化合物を選択する問題が存在します。現在入手可能な多くのフェス化合物は、結晶化条件で一般的に見られる沈殿剤、緩衝剤および添加物と相容れない。これらは、硫酸およびリン酸塩緩衝液に不溶性であり、クエン酸塩および酢酸塩に対して、HEPESおよびTrisバッファーと好ましくない反応をするか、またはDTTおよびβ-メルカプトエタノール21によって隔離される。I3Cフェス化合物はこれらの非互換性に苦しんでいないので、多くの異なる条件に適している可能性がある堅牢なフェスチン化合物です。
本研究では、I3Cフェース化合物とrMMSの同時共結晶化を通じてSADフェージングの準備ができて誘導体化結晶を作製する合理化された方法を提示する。両方の技術の組み合わせは、形態と回折特性を改善した条件の多くを持つ結晶化ヒットの数を増加させます。Orf11 NTD と HEWL の両方のテストケースで、I3C-rMMS 画面の新しい条件が、I3C が存在しないときに存在しなかったことが確認されました。潜在的に、I3Cはタンパク質に良好に結合し、結晶接点27の形成および安定化を促進する。この結果、結晶化を誘導し、回折特性が向上する可能性があります。疎なマトリックススクリーンと互換性のある化合物であることに加えて、I3Cは、その本質的な特性のために魅力的なフェス化合物でもあります。芳香環足場上のヨウ素と交互に作用する官能基は、タンパク質に特異的な結合を可能にする。これは、より大きな占有率につながり、潜在的にバックグラウンド信号23を減少させます。さらに、正三角形における異常散乱散乱装置の配置は、部分構造において明らかであり、I3Cの結合を迅速に検証するために使用することができる(図4B および 4C)。最後に、調整可能な放射光、クロム、銅回転アノードX線源を用いた異常信号を生成することができます。したがって、多くの異なるワークフローに適用できます。I3Cは広く利用可能で購入コストが安いため、このアプローチはほとんどの構造生物学研究所にとって手の届くところにあります。
I3C-rMMS メソッドを使用する場合は、いくつかの実験的な考慮事項に対処する必要があります。タンパク質の初期結晶性材料が得られない場合、この方法は適用できません。困難な場合には、相同タンパク質からの結晶性物質を使用して種子ストックを生成することもできる。rMMSへのこのクロスシードアプローチは、いくつかの有望な結果を示しています 7.種子ストックの希釈によって結晶数を最適化することは、高品質の大きな結晶を生成し、適切な回折データを取得する可能性を最大化するために、見逃してはならない重要なステップです。非対称ユニットで同定されたI3C部位が少ない場合、I3C濃度の上昇により、結晶化に役立つ条件をさらに最適化する必要があります。これは、異常な信号を最大化し、結晶誘導体化を助けるためにI3Cの占有率を増加させる可能性があります。
この手法がタンパク質結晶を誘導する最適な方法ではない場合があります。タンパク質またはタンパク質複合体のサイズが大きくなるにつれて、タンパク質表面上の限られた数のI3C部位は、構造を解決するのに十分なフェージングパワーを提供しない場合がある。タンパク質サイズがフェスを妨げていると疑われるこれらのシナリオでは、タンパク質のセレノメチオニン標識は、タンパク質をフェースするより実行可能なアプローチである可能性があります。タンパク質がタンパク質に十分な数のメチオニン残基を有する場合(100残基あたり少なくとも1つのメチオニンを有することを推奨する65)、高効率のセレノメチオニンをタンパク質に組み込むこと(細菌発現系66など)、複数の高占有セレン原子が結晶中に存在して相相構造に存在する。
また、一部のタンパク質は、I3Cによる誘導体化には本質的に適していない場合があります。タンパク質上のI3C結合部位は、タンパク質構造に依存する。I3C結合と互換性のある露出したパッチが自然にほとんど存在しないタンパク質が存在する可能性があります。したがって、I3Cと一部の標的タンパク質を共結晶化することは困難である可能性があることは予測できない。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ANSTOの一部であるオーストラリアのシンクロトロンでMX1ビームラインで行われました。著者らは、この研究に関する議論のためにシアウィンとブランニング研究所のメンバーを認めたいと思います。著者らはまた、このプロトコルを開拓した元の研究に貢献したサントシュ・パンジカール博士とリンダ・ホワイアット・シアウィン博士を認めたいと考えています。
次の資金が認められています:オーストラリア研究評議会(グラントNos.DP150103009とDP160101450からキース・E・シアウィンへ;アデレード大学(オーストラリア政府研究訓練プログラムは、ジア・クイエン・チュオンとステファニー・グエンに奨学金を得る)。
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |