الوقت تحليل التصوير الفلوري وتحليل غزو الخلايا السرطانية في نموذج 3D Spheroid
Summary
هنا هو بروتوكول لتصنيع جهاز التصوير spheroid. هذا الجهاز يتيح دينامية أو تصوير الفلورية طولية من الخلايا السرطانية spheroids. كما يقدم البروتوكول إجراء بسيط لمعالجة الصور لتحليل غزو الخلايا السرطانية.
Abstract
غزو الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى الأنسجة السليمة المجاورة هي خطوة مبكرة في الانبثاث. وتشكل الخلايا السرطانية الغازية تحديا سريريا كبيرا لأنه لا توجد طريقة فعالة للقضاء عليها بمجرد نشرها. قد يؤدي فهم أفضل للآليات التي تنظم غزو الخلايا السرطانية إلى تطوير علاجات قوية جديدة. بسبب التشابه الفسيولوجي للأورام، spheroids جزءا لا يتجزأ من الكولاجين لقد استخدمت على نطاق واسع من قبل الباحثين لدراسة الآليات التي تحكم غزو الخلايا السرطانية في مصفوفة خارج الخلية (ECM). ومع ذلك، يقتصر هذا الفحص بواسطة (1) عدم التحكم في تضمين spheroids في ECM; (2) ارتفاع تكلفة الكولاجين الأول والزجاج الأطباق القاع، (3) لا يمكن الاعتماد عليها وضع العلامات immunofluorescent، وذلك بسبب اختراق غير فعال من الأجسام المضادة والأصباغ الفلورية و (4) معالجة الصور تستغرق وقتا طويلا، وتحديد كم البيانات. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتحسين بروتوكول الزفير ثلاثي الأبعاد (3D) إلى الخلايا السرطانية المسماة بالفلورسنت والمضمروسة في الكولاجين الأول، إما باستخدام مقاطع فيديو الفاصل الزمني أو التصوير الطولي، وتحليل غزو الخلايا السرطانية. أولا، نحن وصف تصنيع جهاز التصوير spheroid (SID) لتضمين spheroids موثوق بها وفي الحد الأدنى من حجم الكولاجين الأول، والحد من تكلفة المقايسة. بعد ذلك، نقوم بتحديد الخطوات لوضع علامة الفلوريسين القوية على الـ spheroids الحية والثابتة. وأخيرا، نحن نقدم ماكرو فيجي سهلة الاستخدام لمعالجة الصور والبيانات. تماما، توفر هذه المنهجية البسيطة منصة موثوقة وبأسعار معقولة لرصد غزو الخلايا السرطانية في الكولاجين I. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتتناسب مع احتياجات المستخدمين.
Introduction
أثناء تطور السرطان، يمكن للخلايا السرطانية الحصول على نمط ظاهري ظاهري فيضوي، مما يمكنها من الهروب من كتلة الورم وغزو الأنسجة المحيطة1. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الخلايا السرطانية الغازية الوصول والنمو داخل الأجهزة الثانوية، وهي عملية تسمى الانبثاث السرطان1. الانبثاث يسبب أكثر من 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان2. أحد أسباب ذلك هو أنه في حين أن الأورام الموضعية يمكن إدارتها سريريًا ، لا توجد طرق فعالة للقضاء على الخلايا السرطانية الغازية بمجرد حدوث الانتشار النقيلي. ولذلك، فإن ظهور الخلايا السرطانية الغازية والانتقال من مرض محلي إلى مرض غازي يشكل تحديًا سريريًا كبيرًا. تحديد كيفية بدء الخلايا السرطانية والحفاظ على سلوك الغازية قد يؤدي إلى تطوير علاجات قوية جديدة.
نموذج 3D كروي هو منصة مثالية للتحقيق في السلوك الضهر للخلايا السرطانية تحت السيطرة، ولكن الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية3. في الواقع ، في هذا الفحص ، يتم تضمين التواء الخلايا السرطانية داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، على سبيل المثال الكولاجين الأول ، الذي يحاكي ورمًا مبسطًا. ثم، يتم استخدام التصوير لتصور غزو الخلايا السرطانية من الزفير في مصفوفة الكولاجين. ومع ذلك، تحد العديد من التحديات هذا الإجراء.
التحدي الأول يحدث في خطوة التضمين، حيث يمكن أن تنتشر مصفوفة الكولاجين السائل عبر سطح الطبق، مما تسبب في spheroid للمس الجزء السفلي من الطبق. وبالتالي، انتشرت الخلايا من الزفير على السطح ثنائي الأبعاد (2D)، وكسر 3 الأبعاد (3D) المورفولوجيا. زيادة حجم الكولاجين هو حل فعال، ولكن مكلفة. لمنع الخلايا من الانتشار على السطح ثنائي الأبعاد، مع الحفاظ على الحد الأدنى من حجم الكولاجين، قمنا بتطوير جهاز تصوير سفلي (SID) من خلال ربط بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) بسمك 1 مم، ثلاثية الفتحات (PDMS) على طبق زجاجي أسفل.
التحدي الثاني للمقايسة الزفية هو وضع العلامات على الخلايا السرطانية في الزفويد ، والتي يحدها الاختراق الضعيف للأجسام المضادة والأصباغ الفلورية ، وهو تأثير يزيد مع حجم الزفير. في حين أن الحل المثالي للخلايا وضع العلامات هو إنشاء خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن البروتين الفلوري (البروتينات) ، فإن هذا الخيار يقتصر في الغالب على خطوط الخلايا الخالدة ويقتصر على توافر الكيميرا البروتين الفلوري. هنا، ونحن وصف بروتوكول الأمثل لتلطيخ المناعة من الزفيرة، فضلا عن الاستخدام الفعال لصبغة السيتوبلازمية لتسمية الخلايا مباشرة قبل تضمين الزفيرويد.
التحدي الثالث للمقايسة الكروية هو عدم وجود وحدات ماكرو فيجي بسيطة للتحديد الكمي شبه الآلي لغزو الخلايا بمرور الوقت. لمعالجة هذا التحدي، نحن وصف منهجية بسيطة لتحليل منطقة spheroid على مر الزمن. نحن نوضح مزايا هذا البروتوكول باستخدام خطوط الخلايا 4T1 و 67NR كأمثلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم المساحة المطبوعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء أوراق سميكة من 1 مم من PDMS يمكن استخدامها بعد ذلك لإنشاء أشكال مختلفة من PDMS بسهولة ، كما هو مطلوب من التطبيقات التجريبية. نظرا لبساطة تلفيقه وحرية تغيير التصميم، تم اختيار هذا الأسلوب من الصب PDMS للتصميم الأولي لل SID. إذا كان هناك حاجة إلى حجم كب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء معبد الهندسة الحيوية لمناقشات قيمة. نشكر ديفيد أمبروز في قلب التدفق الخلوي (كلية لويس كاتز للطب) لمساعدته في فرز الخلايا وتوني بوهم من مركز الأفكار (كلية الهندسة، جامعة تمبل) للمساعدة في الطباعة ثلاثية الأبعاد. كما نشكر موارد التمويل الخاصة بنا: منحة الباحث الباحث في جمعية السرطان الأمريكية 134415-RSG-20-034-01-CSM، قهر السرطان الآن / جائزة المحقق الشاب، المعاهد الوطنية للصحة، R00 CA172360 وR01 CA230777، كل إلى BG.
Materials
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. . SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V., Dmitriev, R. I. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
