미세 조류의 모델 개선을 위한 높은 처리량 신진 대사 프로파일링

Summary

이 프로토콜은 표현형 마이크로어레이(PM) 기술 플랫폼을 사용하여 녹색 미세조류인 클라미도모나스 레인하르트티의 대사 요건을 정의하고 기존 대사 네트워크 모델을 구체화하는 것을 보여줍니다.

Abstract

신진 대사 모델은 유기체의 사용 가능한 게놈 성서에 따라 재구성되고 시스템 수준에서 신진 대사 과정을 연구할 수있는 예측 도구를 제공합니다. 게놈 규모 대사 모델은 실험적으로 확인되지 않은 반응뿐만 아니라 갭을 포함할 수 있다. 새로 고립 된 미세 조류 종의 재구성 된 모델은 이러한 분리물의 대사에 사용할 수있는 일반적으로 희소한 생화학 적 증거가 있기 때문에 이러한 격차로 인해 약점을 초래할 것입니다. 표현형 마이크로어레이(PM) 기술은 다양한 항목 대사산물에 대응하여 세포 대사 활동을 기능적으로 결정하는 효과적인 고처리량 방법입니다. 높은 처리량 현상제 분석을 대사 모델링과 결합하면 기존의 신진 대사 네트워크 모델이 유전체 증거를 지원하고 확장하기 위해 생화학적 증거를 제공함으로써 빠르게 재구성하거나 최적화될 수 있습니다. 이 연구는 녹색 미세 조류 모델 종 Chlamydomonas reinhardtii를 예로 사용하여 미세 조류연구를 위한 PM 애서의 사용을 보여줍니다. PM에 의해 얻어진 254개 이상의 반응에 대한 실험적 증거는 이 연구에서 게놈 규모의 C. reinhardtii 대사 네트워크 모델iRC1080을 약 25% 확장하고 정제하는 데 사용되었습니다. 여기에서 생성된 프로토콜은 알려진 미세 조류 돌연변이및 새로운 분리제를 포함하여 다른 미세 조류의 신진 대사를 기능적으로 프로파일링하기 위한 기초로 사용될 수 있다.

Introduction

표적 대사 산물의 향상되고 안정적인 생산을 위한 조류 대사를 최적화하려면 신진 대사 네트워크의 시스템 수준 분석을 통해 복잡한 신진 대사 엔지니어링 전략의 개발이 필요합니다. 신진 대사 네트워크 모델은 최적화전략^1,2,3,4의급속한 발전을위한 합리적인 디자인을 안내 할 수 있습니다. 약 160개의 미세조류종이 5개 시퀀시되었지만, 우리의 지식에는 44개의 조류 대사 모델만^4,6,7을사용할 수 있다. 게놈 정보의 실험적 검증을 위한 고처리량 대사 현상제 데이터를 얻는 데 어려움이 있기 때문에, 고품질 네트워크 모델의 재구성은 조류 게놈 시퀀싱의 급속한 발달에 뒤쳐진다.

C. reinhardtii는 조류 기반 연구를위한 매력적인 모델 시스템입니다. 이 종은 광연 또는 이종성 또는 이종성으로 성장할 수 있으며 기본 및 적용 연구에서 모델 유기체로 널리 사용되어 왔습니다. 그것의 게놈 순서는 2007년에 간행되었습니다^8,게놈 규모의 신진 대사 모형은 이후에 종^9,10,11를위해 재구성되었습니다. C. reinhardtii (iRC1080)에 대한 게놈 스케일 모델은 장 외에 의해 재구성되었다. ¹⁰ 게놈 및 문학 증거에 따라 (수반 ~ 250 소스). 그것은 있다 1,706 대사 산물 와 2,190 반응^10; 그러나 모델의 완전성은 당시 사용 가능한 게시된 실험 증거를 넘어서는 확인할 수 없었습니다.

표현형 미생물어레이(PMs) 기술은 이성영양 미생물뿐만 아니라 조직 배양 세포에 대한 대사 프로파일링 정보를 제공할 수 있는 고처리량 플랫폼이다. 특히, 클라미도모나스 레인하르트티(12)에대해 최초보고된 바와 같이, 마이크로조류에서 표현형-유전자형 지식 격차를 해결하는 데 사용될 수 있으며, 이후 클로로이듐¹³ 및 클로렐라(14)의 종에 대해 서술할 수 있다. 수천 개의 대사 산물, 신호 분자, 삼투혈, 이펙터 분자에 대한 세포 반응을 연구함으로써 PM 에세이는 기능성 대사 프로파일링을 제공하고 기능, 신진 대사 및 환경 민감도^15,16,17에대한 통찰력을 제공할 수 있다. 구체적으로, PM 어약은 각 우물에 포함된 다른 양분, 대사 산물 또는 삼투석이 있는 96웰 마이크로플레이트에서 세포 대사산물 활용을 검출한다. 또한 항생제 및 호르몬과 같은 생리 활성 분자를 분석할 수도 있습니다. 테트라졸륨 계 제독염의 NADH 감소에 의한 색 생산의 강도에 의해 결정된 바와 같이, 기판의 대사 활용은 세포^{호흡(15,16,17)의}관점에서 평가된다. 96웰 마이크로플레이트의 실험은 표현형 마이크로어레이 기기(PMI) 플랫폼을 통해 시간이 지남에 따라 자동으로 모니터링및 확인할 수 있습니다. 20 96웰 마이크로플레이트는 다른 삼투성/이온 및 pH 효과와 함께 탄소, 질소, 황 및 인 소스를 활용하기 위해 세포 표현형을 연구하기 위해 일반적인 세트 대사 산물을 나타내도록 설계되었습니다. PM기술은 미생물^{15,16,17,18에}대한 다수의 기존 게놈 규모의 대사 모델을 업데이트하고 업그레이드하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.

여기에 표시된 프로토콜 및 데이터는 Chaiboonchoe 등의 이전에 게시 된 작품을 기반으로합니다. ¹² 제시된 작품에서는 미세조류의 대사 표현형을 특성화하고 C. reinhardtii의 기존 조류 대사 모델을 확장하고 새로운 대사 모델의 재구성을 안내하기 위해 PM 분석 방법의 사용을 상세히 설명합니다.

Protocol

1. 표현형 마이크로어레이 실험 미국 미네소타 대학교(https://www.chlamycollection.org)의 클라미도모나스 자원 센터에서 C. 레인하르트티균CC-503을 획득하십시오. 400 μg/mL 타임엔틴, 50 μg/mL 암피실린, 100 μg/mL 암피실린, 100 μg/mL 카나마이신(세균 성장을 억제하기 위해) 25°C에서 25°C에서 2단계 로 의 최종 농도를 가진 신선한 Tris-Acetate-Phosphate(TAP) 매체19에서 세포를 성장시한다. 22°C에서 10분 동안 2,000 x g의 배양을 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다. 0.1% 테트라졸륨 바이올륨 염료 “D”가 포함된 신선한 TAP 미디어를 준비합니다.참고: 각 플레이트에서 테스트된 대사산물 범주에 따라 일부 영양소를 제외하기 위해 이 단계에서 TAP 미디어를 수정합니다(예: 질소 소스 플레이트에 대한 염화암모늄 제외). 준비된 신선한 TAP 매체에서 펠릿을 1 x 106 셀/mL의 최종 농도로 재중단합니다( 1.2단계부터) 화학 화합물 어레이 분석 플레이트(탄소 공급원, 질소 공급원, 인 및 황 소스 플레이트 및 펩타이드 질소 소스)를 사용합니다. 세포 함유 매체의 100 μL 알리쿼트를 분석 플레이트의 각 웰에 접종한다.참고: 에세이를 복제해야 합니다. 효모 추출물 /펩톤 플레이트에 줄인 세포를 줄이며 스미스 외에서와 같이 그램 염색을 수행합니다. 20 세균 오염을 모니터링하기 위해 분석 전후. 마이크로 플레이트 판독기 시스템에 화학 화합물 어레이 분석 플레이트를 삽입합니다. 모든 플레이트를 최대 7일 동안 30°C의 배양하고 마이크로플레이트 판독기 시스템을 프로그래밍하여 15분마다 염료 색 변화를 판독합니다.참고: 대부분의 마이크로플레이트 판독기는 인큐베이션 중에 연속광의 원천을 제공하지 않기 때문에 조류는 이종성 호흡을 수행 할 수 있어야합니다. 2. 데이터 분석 마이크로플레이트 판독기에서 원시 운동 데이터를 CSV 파일로 내보내서, 이후 R.에서 옴니로그 표현형 마이크로어레이(OPM) 패키지에 입력으로 사용될 것이며, 메타데이터(예: 변형 지정, 성장 매체, 온도 등)로 생물학적 정보를 추가한다. PM Kinetic 데이터 변환기 소프트웨어를 사용하여; D5E 데이터 파일을 로드하고 PM 역학 분석 소프트웨어에서 다음 명령줄을 사용하여 OKA 파일로 변환합니다.로드 | 가져오기(OKA 파일 폴더 찾기) | 필터 | 채우기 가져오기 | 모든 플레이트 | 추가 닫다.수출 | 읽기 데이터(Kinetic)를 선택하고, 형식(CSV)(Tabulate 헤더)을선택하고 플레이트(모든 플레이트(개별 파일)를 선택합니다| 데이터 | 내보내기 구해내다. Phenotype 마이크로어레이(PM) 데이터 분석을 수행하려면 R 소프트웨어 환경에서 실행되는 OPM 소프트웨어 패키지21,22를 사용합니다. 패키지, 자습서 및 참조 설명서는 http://www.goeker.org/opm/. RStudio에서 R용 그래픽 사용자 인터페이스는 다음 명령을 사용하여 opm 패키지와 해당 종속성을 설치합니다.소스 (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)라이브러리 (opm) 운동 데이터의 CSV 파일을 포함하는 디렉터리로 이동하여 read_ opm 함수를 사용하여 데이터를가져옵니다. x <- read_opm("",,]="grp", 포함=목록("csv:")) 곡선 파라미터 추정을 사용하여 운동 데이터를 집계하고 다시 분리합니다.(1 :길이(x)에서 i) {x [[i]] <나는 _aggre (x[[i]], 부팅 = 0 L, 코어 = 1 L, 방법 = "스플래쉬", 옵션 = set_spline_options ("smooth.spline")))x[i]] <- do_disc(x[i]], 컷오프 = FALSE)}메타데이터의 #Collection메타데이터 <-collect_template(".")메타데이터$스트레인 <-c("블랭크","CC-503")(1 :길이(x)) { x[[i]] < include_metadata(x[[i]], md = 메타데이터, 대체 = TRUE)} } xy_plot 함수를 사용하여 분석된 96웰 플레이트에 대한 시간(x 축)의 함수로서 호흡(또는 성장) 측정(y축)을 매핑합니다.인쇄(xy_plot(x[[[ 1], =”스트레인”, 이론.max = FALSE)) level_plot 함수를 사용하여 데이터를 히트 맵으로 시각화하여 운동 데이터의 빠른 비교 개요를 허용합니다.level_plot (x, 메인 = 목록 (), 색상 = opm_opt (“color.borders”), panel.headers = 메타데이터 $ 스트레인, cex = NULL, strip.fmt = 목록 (), striptext.fmt = 목록 (), legend.9ep =”, 공간 =”실험실”, 바이어스 = 0.7 , num.colors = 200 L) 중요한 생물학적 정보, 곡선 파라미터, 원시 운동 곡선으로부터 의 지연 단계(λ), 성장속도(μ), 최대 세포 호흡(A), 및 곡선(AUC) 아래 영역(AUC)(21)을포함한다. 양성 대사 산물을 식별하려면 각 마이크로웰 플레이트의 공백 외에도 매질염의 비생물 반응성을 나타내는 음수 제어값의 A 값을 배경 빼기 값으로 사용합니다. 추출 함수는 A 매개 변수를 얻기 위해 사용됩니다.opm_opt(“곡선.param”)파라마 <- 추출물(x, as.labels = 목록("스트레인"))) 3. 새로운 대사 산물과 관련된 반응 과 유전자의 식별 검색 KEGG(교토 유전자 및 게놈의 교토 백과사전) (http://www.genome.jp/kegg/) 및 메타심(http://metacyc.org/)은 화학 화합물 어레이23,2423,24에서발견되는 대사산물을 이용한 반응에 대한 효소 위원회 번호(EC)를 식별한다. 확인된 EC 번호를 공동 게놈 연구소(JGI), 식물성조메(http://www.phytozome.net), 및 동료 평가간행물(23,25,26,27)과같은 다중 사용 가능한 조류 성화 자원에서 검색 기반으로사용한다. 쿼리가 주어진 EC 번호에 대한 유전적 증거가 반환되지 않는 경우, C. reinhardtii에가장 가까운 종으로 시작하여 다른 유기체에서 관련 단백질을 식별한 다음, NCBI PSI-BLAST 서버를 사용하여 프로파일 기반 검색을 수행하고 C. reinhardtii(taxid:3055)에서 비중복 단백질(nr)을 사용하여12명의관련 유전자 를 식별합니다. EMBL-EBI Pfam(http://pfam.xfam.org/search) 또는 InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 단백질 도메인 예측 서버를 통해 블라스트 히트를 쿼리하여 검색된 EC 번호와 관련성을 < 0.05의 E 값으로 PSI-BLAST 히트를 수동으로 선별합니다. 후자의 두 검사는 단백질에 대한 올바른 효소 활성의 식별을 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 4. 모델 개선 및 평가 최신 COBRA 툴박스 v.3.0 사용28마트랩에서29,30모델 개선을 위한 다음 단계를 수행할 수 있습니다. COBRA 도구 상자는 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html 단계를 따라 설치할 수 있습니다. 또는 코브라 툴박스는 파이썬(COBRApy)과 같은 다른 오픈 소스 프로그래밍 언어에서도 구현됩니다.31) https://opencobra.github.io/cobrapy/ .COBRA 도구 상자 v.3.0을 설치한 후 MATLAB을 열고 다음 명령을 실행하여 도구 상자를 초기화합니다.이니코브라툴박스; 코브라 툴박스 기능을 사용하여 iRC1080과 같은 대사 모델에 관련 유전자를 이용한 확인된 반응을 추가하여 반응을 더하고 유전자 연결을 변경한다. iRC1080 모델을 포함하는 디렉터리로 이동하여 http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 다운로드한 다음 명령을 실행하여 모델을 로드하고 이름을 변경한 다음 새로운 반응 및 관련 유전자를 추가합니다.부하(‘iRC 1080.mat’)modelNew = iRC 1080;모델 뉴 = 추가 반응 (모델 새로운, ‘D-ALA 2’, …{‘d-ala[c]’ , ‘atp[c]’ , …’D-알라데이터[c]’, ‘adp[c]’ , ‘pi[c]’ , …’h[c]’ },[- 2 – 1 1 1 1],거짓);modelNEW = 변경유전자 협회 (모델 새로운, …’D-ALA 2′,’au.g 14655 _t 1′ ); 어떤 경우에는 대사산물이 세포내에서 생산되지 않고 매체에서 채택될 때, 모델에 새로운 대사산물에 대한 수송 반응을 추가한다. 이러한 수송 반응은 세포외 배지에서 사이토솔까지 대사산물의 수동확산을 나타낸다. 또한, 상기 addExchangeRxn 기능을 이용하여 대응하는 인공 교환 반응을 추가하여 대사산물을 세포외 배지로 입력하거나 출력한다.모델 뉴 = 추가 반응 (모델 새로운, ‘CYCPt’, …{‘cycp[e]’,’cycp[c]’ },[- 1],true)’modelNew = addExchangeRxn (modelNew, ‘cycp[e]’, – 1000,1000); 새로운 결과 모델,예를 들어, iBD1106의 동작을 객관적인 기능으로 바이오매스의 극대화를 위한 밝고 어두운 조건하에서 기능 최적화CbModel을 사용하여 플럭스 밸런스 분석(FBA)을 수행하여 테스트한다. 광 성장을 위해 PRISM 태양 리소의 빛 반응의 하부 및 상한을 646.07(최대 속도)로 설정합니다. 어두운 성장을 위해 모든 PRISM 빛 반응의 경계를 0으로 설정합니다. 어둡고 가벼운 조건에서 성장을 위해 이전에10으로 정의된 Biomass 함수를 사용합니다. FBA 솔루션은 반응 플럭스(solution.v) 및 비용 절감(solution.w)에 대응하는 두 개의 벡터와 대사 산물의 그림자 가격(solution.y)에 대응하는 하나의 벡터를 출력합니다.%빛 조건에서 성장을 시뮬레이션합니다.모델 뉴 = 변경RxnBounds (모델새로운,{…% ‘PRISM_solar_litho’, …’PRISM_solar_exo’, …’PRISM_incandescent_ 60 W’, …’PRISM_fluorescent_cool_ 215 W’, …’PRISM_metal_halide’, …’PRISM_high_pressure_sodium’, …’PRISM_growth_room’, …’PRISM_white_LED’, …’PRISM_red_LED_array_ 653 nm’, …’PRISM_red_LED_ 674 nm’, …’PRISM_fluorescent_warm_ 18 W’, …’PRISM_design_growth’, …}, 0, ‘b’ );modelNew = 변경 목표(modelNew, ‘BIOMASS_Chlamy_mixo’);FBAsolutionNew = 최적화CbModel(모델뉴, 최대)); i RC1080에 대해 4.1.4를 반복하여 iBD1106에 대해 얻은 FBA 솔루션과 iRC1080을 위해 얻은 솔루션과 비교합니다. 모델을 비교하는 데 사용할 수 있는 다양한 COBRA 방법이 있습니다(예: 플럭스 가변성 분석, 유전자 삭제 연구, 견고성 분석, 플럭스 분할 예측, FBA, 샘플링 등). 자세한 자습서는 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html 찾을 수 있습니다. 여기서, i RC1080 모델이 각 모델에서 차지하는 대사산물의 그림자 가격(시스템 변수의 변화에 대한 바이오매스 객관적 함수의 감도)을 얻어, 정제된 버전, iBD1106과 비교되는 예가 제공된다.대사 산물에 대한 그림자 가격을 가져옵니다 :그림자가격 = 테이블(modelNew.mets, …modelNew.metnames, FBAsolutionNew.y);

Representative Results

모델 조류 클라미도모나스 레인하르트티의 표현형 마이크로어레이 스크리닝PM 에세이는 최소한의 배지에서 다양한 탄소, 질소, 황 및 인의 다양한 공급원을 활용하는 조류의 능력을 테스트합니다. 이 방법 설명에서, 우리는 PM 소약이 탄소와 질소 대사를 확인하기 위하여 어떻게 이용되었는지 보여주었습니다. 탄소 및 질소 활용 역학은 마이크로 플레이트 판독기로 측정하였다. 데이터는 PMI 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 선택한 PM 분석 플레이트(PM01 및 PM03)의 요약 역학은 그림 1에표시됩니다. “xy 플롯”은 y축 및 x축이 각각 원시 측정값과 시간의 값을 나타내는 96웰 플레이트의 애서에 대해 플롯된 시간에 따라 호흡 측정값을 표시합니다. 데이터는 운동 데이터의 어셈블리를 비교적 분석하기 위해 열맵 패턴으로 변환되었습니다. PM 데이터를 이용한 게놈 규모의 대사망 정제파이프라인(그림 2)은게놈 검색에 의해 제공된 실험적 증거와 함께 고처리량 PM 분석의 통합을 보여 대사 네트워크 모델을 확장할 수 있다. PM01-04 및 PM10 플레이트로부터 얻은 PM 데이터의 재현성을 결정하기 위해, 선형 회귀는 서로에 대한 두 개의 독립적인 복제 실험으로부터 데이터를 플롯하도록 분석하였다(그림3). 그림 3은 대부분의 데이터가 45° 라인에 떨어질 때 거의 비슷했으며, 몇 개의 이상값만 존재하고, 결단력 R2의 계수는 0.9이었다. 조류에 대한 실험의 일관성과 재현성은 이 플롯에 의해 확인됩니다. 새로운 대사 산물의 식별PM 분석 결과 7개의 플레이트에서 662개의 대사산물을 확인했습니다. PM01-PM04 및 PM06-PM08, 가스 크로마토그래피 시간 비행 시간 (GC-TOF)는 77 대사 산물32 (그림 4)를확인했다. iRC1080에 기록된 1068대사산물과 이 두 세트를 비교할 때, 3세트 사이에 는 6개의 대사산물과 149개의 대사산물만이 iRC1080과 PM 사이에 겹쳐지었다. 이 결과는 신진 대사 프로파일링 플랫폼이 새로운 신진 대사 정보의 중요한 근원이 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 아세트산은 배경 신호를 빼고 나서 지지 탄소로서 PM01 플레이트PM01에서 검출된 유일한 탄소 원이었다. 이 발견은문헌(33)과 일치하며 PM 에세이의 특이성을 보여줍니다. PM 의 에세이는 C. reinhardtii가 성장을 위해 활용할 수있는 새로운 황, 인 및 질소 소스를 공개했다. 황 대사 산물은 황산염, 티오스울페이트, 테트라티오나테, DL-리포아미드였다. 인 소스는 티오포스페이트, 디티오포스페이트, D-3-인-글리세산, 시스팀신-S-인산염이었다. 질소 소스 대사 산물 L 아미노산 및 D 아미노산, 덜 일반적인 아미노산을 포함 하 여; L-호모세린, L-파이로글루타믹, 메틸라민, 에틸라민, 에탄올라민, D, L-α-아미노-부티릭, 108디펩타이드 및 5개의 트라이 펩타이드(표 1). 새로 확인된 128개의 대사산물은 모두 KEGG와 MetaCyc에서 그들의 관련 반응, EC 번호 및 통로를 위해 수색되었습니다. 새로운 128 대사 산물49 고유 EC 번호와 연관되었다. 이들 중, 15 개의 IC는 포함 하 여 5 개의 소스를 사용 하 여 그들의 게놈 증거에 연결 되었다; 식물성 조메 버전 10.0.234 JGI 버전 435,아우구스투스 5.0, 및 5.210 마니카이쿨 등에서 주석. 36 및 KEGG13. 유전체학적 증거가 없는 대사산물은 유니버설 단백질 자원 웹 사이트(UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38에 입력되어 관련 서열이 다른 유기체에서 발견되었습니다. C. 라인하르트티의 동종 서열은 중요한 정렬(E-value <0.005)을 생성한 시퀀스만 을 고려하여 NCBI 웹 사이트에서 위치별 반복 폭발(PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 실행하여 확인되었습니다. 모델 개선새로운 128 대사 산물과 관련된 반응은 인코딩 된 유전자와 함께 iRC1080 모델에 추가되어 네트워크를 확장했습니다. 결과 모델 iBD1106은 2,444반응, 1,959개의 대사산물 및 1,106개의유전자(표 2)를차지합니다. 새로운 254첨가 반응은 20개의 아미노산 산화 반응, 108디펩타이드 가수분해 반응, 5개의 트리펩타이드 가수 분해 반응, 120개의 수송 반응, 4개의 유전자에 의해 인코딩된 (Cre02.g02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.10)이었다. 총 113개의 새로운 반응이 디 펩타이드와 트라이 펩타이드의 가수분해를 고려했다. 디 펩티드 및 트라이 펩타이드의 가수분해는 디 펩타이드(Cre02.g02.g078650.t1.3)와 트라이 펩타이드(Cre16.g675350.t1.3)에 대한 두 가지 유전자와 관련이 있다. 인의 근원에 관하여, 시증기민 및 인산염으로 cysteamine-S-인산염의 가수분해를 위한 반응이 JLM_162926 유전자와 연관되었다. WoLF PSORT 도구39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) 및 Ghamsari 외에 의해보고 된 결과. 35는 새로운 반응이 일어나는 셀룰러 구획의 사양을 얻기 위해 적용되었다. 새로운 반응과 관련된 단백질 서열을 분석함으로써, WoLF PSORT는 반응에 대한 세포 구획으로 사이토솔을 예측했다. 생성된 신진 대사 모델은 생화학 정보가 불완전할 때 틈새를 포함할 수 있다. 이러한 경우, gapFind,COBRA 명령이 사용됩니다. 루트 격차를 나열하고 새 모델에서 새로운 간격 을 식별할 수 있습니다. 대사 모델에서 생성할 수 없는 대사산물은 루트갭(40,41)이라고한다. 루트 갭을 분석하면 iRC1080 및 iBD1106 모델 모두 동일한 91 개의 간격을 포함하고 있음을 나타냅니다. 이것은 새로운 대사 산물과 관련 반응을 추가하는 것은 추가적인 루트 간격을 소개하지 않았다는 것을 보여줍니다. 원래 루트 갭 대사 산물이 전송 또는 생산 메커니즘이 부족하기 때문에이 프로토콜에 사용되는 phenotyping 방법은 표면 분석에서 해결되지 않았기 때문에 이 프로토콜에 사용되는 phenotyping 방법이 루트 격차를 닫지 않는다는 점에 유의해야합니다. 플럭스 밸런스 분석은 빛과 어두운 조건하에서 iBD1106의 대사 적 행동을 테스트하기 위해 수행되었다; (아세테이트 없음) 및 (아세테이트 없음). 이 알고리즘은 객관적인 기능(바이오매스 성장)에 대한 바이오매스 전구체 반응을 극대화합니다. 각 대사산물의 집합 목표 함수에 대한 참여를 평가하기 위해 모든 대사 산물에 대한 “그림자 가격”이 계산되었습니다. 대사 산물의 유동 변화에 관한 객관적인 기능의 변화는 대사 산물30,42의그림자 가격을 정의한다. 대사산물이 “과잉” 또는 객관적인 기능을 “제한”하고 있는지 여부를 나타내는 것은 섀도우 가격 분석( 예: 바이오매스 생산)에 의해 결정될 수 있다. 음수 또는 양수 그림자 가격 값은 추가시 객관적인 함수를 감소하거나 증가시킬 대사 산물을 드러냅니다. 그림자 가격의 제로 값은 객관적인 기능에 영향을 미치지 않는 대사 산물을 드러냅니다. 그림 5에서 iBD1106과 iRC1080 사이의 그림자 가격의 비교는 대부분의 대사 산물에 대해 중요한 변화가 관찰되지 않는다는 것을 보여줍니다. 그러나, 다름은 각각 빛과 어두운 성장 조건의 밑에 105 그리고 70의 케이스에서, 찾아냈습니다. 표 4에는 이러한 대사 산물의 예가 포함됩니다. 그림 1: C. reinhardtii의Phenotypic 미세 어레이 프로파일링 . PM01의 호흡 XY 플롯 및 레벨 플롯(탄소 소스; A, C) 및 PM03 (질소 소스; B, D) 분석 플레이트가 표시됩니다. 이 그림은 각 셀이 잘 플레이트를 나타내고, 따라서 주어진 대사 산물 또는 성장 환경을 나타내는 8×12 배열입니다. 각 셀 또는 잘 표현 내에서 곡선은 시간(x 축)의 함수로서 감소(y축)에 의한 염료 변환을 나타냅니다. CC-503 및 빈 우물의 PM 호흡 곡선은 각 셀에 표시되며 색상으로 표시됩니다(청록색은 빈 우물을 나타내고 보라색은 CC-503을 나타냅니다). 레벨 플롯은 시간이 지남에 따라 색상(또는 변경되지 않은 상태로 유지)을 변경하는 얇은 수평 선으로 각 호흡 곡선을 나타냅니다. 히트맵 색상 변경은 밝은 노란색(호흡이 거의 또는 전혀 일어나지 않았다)에서 어두운 주황색 또는 갈색(상당한 호흡이 일어났습니다)까지입니다. C. 라인하르트티(CC-503)와 빈 플레이트에 의해 활용되는 대사산물이 표시됩니다. 이 수치는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 2: PM 데이터를 이용한 게놈 규모의 대사 네트워크 개선 파이프라인. PM 분석에서 양성 새로운 화합물 테스트 후, 그 효소 위원회 번호 (EC), 반응, 그리고 경로 사용 가능한 데이터베이스에서 확인, 예를 들어, KEGG와 메타사이클. 유전체학적 증거는 유전체및 성문 자원에서 추출되어 사용 가능하고 게놈형과 표현형 사이의 연관성을 구성한다. 직접적인 게놈 증거를 사용할 수 없는 경우, 단백질 서열은 EC 숫자에서 확인되고, 유전 적 증거는 PSI-Blast를 통해 확인된다. 재구성된 신진 대사 네트워크는 새로 확인된 화합물을 기반으로 정제되지만 관련 데이터베이스를 사용하여 단백질 도메인을 쿼리하는 품질 관리 단계 후에만 구체화됩니다. 이 수치는 Chaiboonchoe 등에서 이전에 출판 된 작품에서 수정되었습니다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 3: PM 테스트의 재현성. PMI 값은 168시간 동안 수집되었으며 두 개의 복제 스터디에 대해 최대 PMI 값이 플롯되었습니다. 각 축은 각 스터디의 최대 PMI 값을 나타냅니다(x축은 하나의 복제 스터디이고 다른 y축). 재현된 값은 각 축과 동등합니다. 각 점은 단일 최대 값을 나타냅니다. 선형 회귀는 스프레드시트 소프트웨어에 의해 수행되었고, 결과 결정 계수(R2)가 나타났다. 이 수치는 Chaiboonchoe 등에서 이전에 출판 된 작품에서 수정되었습니다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 4: 대사 산물의 벤 다이어그램. 벤 다이어그램은 PM 플레이트, iRC1080 대사 모델 및 가스 크로마토그래피 비행 시간(GC-TOF) 실험에 의해 확인된 대사산물을 예중화합니다. 각 원은 각 각 연구 방법에 존재하는 대사 산물의 총 수를 나타냅니다. 동시에 중첩 된 영역은 이러한 메서드 간에 공유된 대사 산물 수를 나타냅니다. iRC1080 대사 모델은 총 1,068개의 독특한 대사산물을 함유하고 있습니다. GC-TOF는 총 77개의 대사산물32를확인했으며, PM 플레이트를 사용하여 확인된 총 662개의 대사산물이 있습니다. 이 수치는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: iRC1080 및 iBD1106에서 대사 산물의 그림자 가격은 바이오 매스 최대화를위한 다른 조건하에서. “레이더 플롯”의 각 원은 그림자 가격 값에 해당하며 플롯의 중심에서 확장되는 각 선은 대사 산물을 나타냅니다. (A) i RC1080 및 iBD1106의 그림자 가격 및 대사 행동은 가벼운 성장 조건하에서; (B), iRC1080 및 iBD1106의 다른 대사 행동은 어두운 성장 조건 하에서. 이 수치는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 바이오로그 케미컬 EC* 유전자 성화 PSI-블라스트 사이스팀신-S-인산염 3.1.3.1 JLM_1629261,2,3,4 테트라티오나테 1.8.2.2 사소한 전자 값 1.8.5.2 사소한 전자 값 D-알라닌 1.4.1.1 XP_001700222.1 1.5.1.22 실패한 수동 QC 2.1.2.7 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 2.3.2.10 사소한 전자 값 2.3.2.14 사소한 전자 값 2.3.2.16 사소한 전자 값 2.3.2.17 사소한 전자 값 2.3.2.18 사소한 전자 값 2.6.1.21 실패한 수동 QC 3.4.13.22 XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1 3.4.16.4 Chlre2_kg.scaffold_ 140000391,2,3 3.4.17.8 실패한 수동 QC 3.4.17.13 사소한 전자 값 3.4.17.14 사소한 전자 값 4.5.1.2 사소한 전자 값 6.1.1.13 실패한 수동 QC 6.1.2.1 실패한 수동 QC 6.3.2.4 au.g14655_t11,2,3 6.3.2.10 실패한 수동 QC 6.3.2.16 사소한 전자 값 6.3.2.35 사소한 전자 값 D-아스파라진 1.4.5.1 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 3.1.1.96 사소한 전자 값 2.3.1.36 사소한 전자 값 1.4.99.1 XP_001692123.1 3.5.1.77 e_gwW.1.243.1,2 3.5.1.81 사소한 전자 값 5.1.1.10 실패한 수동 QC D-아스파르산 6.3.1.12 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-글루타믹 산 1.4.3.7 사소한 전자 값 1.4.3.3 사소한 전자 값 D-리신 5.4.3.4 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 6.3.2.37 실패한 수동 QC D-세린 2.7.11.8 사소한 전자 값 2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31,2,3,4 3.4.21.78 실패한 수동 QC 3.4.21.104 실패한 수동 QC 4.3.1.18 g6244.t14 실패한 수동 QC 6.3.2.35 사소한 전자 값 6.3.3.5 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-발린 1.21.3.1 실패한 수동 QC 6.3.2.26 실패한 수동 QC 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 L-파이로글루타믹 산 티오포스페이트 디티오포스페이트 에틸라민 6.3.1.6 D,L-아미노 부티릭 산 2.1.1.49 사소한 전자 값 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 디 펩타이드 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31 트라이 펩타이드 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31 표 1: iRC1080 대사 모델에 존재하지 않는 확인된 양성 기판 활용 대사산물(C, P, S, N) 목록.   *유전자가 확인되지 않은 경우 반응이 포함되지 않았습니다.  1 식물성 버전 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI 버전 4 35.  3 아우구스투스 버전 510.  4 케그 (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI 버전 3.136.  이 표는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12 모델 반응 대사 산물 유전자 iRC1080 2,191 1,706 1,086 iBD1106 2,445 1,959 1,106 표 2: iRC1080 및 iBD1106의내용 .  이 표는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12 범주 또는 반응 클래스 반응 수 아미노산 20 디펩타이드 108 트리페타이드 5 운송 반응 120 표 3: iBD1106의 새로운 반응 요약. 이 표는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12 성장 조건 대사 산물 이름 iRC1080 iBD1106 4r5au 4-(1-D-리비틸라미노)-5-아미노우라실 0 0.168 5aprbu 5-아미노-6-(5′-인포리비틸아미노)우라실 -0.009 0.158 광 pa1819Z181111Z 1-(9Z)-옥타데데노일, 2-(11Z)-옥타데노일-센-글리세롤3-인산염 -0.009 -0.65 어둠 4abut 4-아미노부타노아이트 0.18 -0.05 표 4: iRC1080 및 iBD1106에 대한 상당한 그림자 가격의예. 이 표는 Chaiboonchoe 등의 이전에 출판 된 작품에서 입니다. 12

Discussion

녹색 미세알가, C. reinhardtii의대사 표현은 여기에서 높은 처리량 PM 분석 플레이트 및 수정되지 않은 PMI를 사용하여 설명되었다. 이 소는 펩타이드 질소 공급원(PM06-08)과 함께 총 190개의 탄소 공급원(PM01 및 PM02), 95개의 질소 공급원(PM03), 59개의 인 소스 및 35개의 황 공급원(PM04)을 위해 활용되었다. 양성 호흡은 148개의 영양소(C-source 활용을 위한 1개의 긍정적인 분석, 각각S-source 및 P-source 활용에 대한 4개의 긍정적인 분석, 그리고 N-source 활용을 위한 139개의 양성 분석)에 대해 관찰되었다. 매체의 기질 또는 영양소(탄소, 질소, 인 또는 유황) 성분은 각 소스에 대해 테스트하는 관련 PM 마이크로플레이트에 적용될 때 정의된 매체에 첨가해서는 안 된다.

여기에 도시된 방법은 기존 대사 네트워크 모델을 확장하거나 새로운 모델의 재구성을 지시하는 데 사용될 수 있는 대사 미세조류 표현형을 특성화하는 데 효과적이다. 또한 대부분의 미세 조류의 영양 요구 사항이 알려지지 않았기 때문에 이 플랫폼을 사용하여 이러한 플랫폼을 신속하게 정의할 수 있습니다. 넬슨 외. ^43은 이러한 방법을 성공적으로 적용하여 미세조류 클로로이듐 Sp의 성장을 지원하는 새로운 화합물을 식별하고, 클라미도모나스와 는 달리 40개의 다른 탄소 공급원을 포함하는 종 진입 대사산물을 정의하는 데 얻은 정보를 사용했다.

미세 조류 프로파일링을위한 PM의 한 가지 주요 제한은 PMI가 잠복실에 조명이 없고 미세 조류가 이종국 대사를 수행 할 수 있어야한다는 것입니다. 빛의 부재는 신진 대사 플럭스를 계산하기 위해 빛을 통합 하는 모델의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 조정 기능을 갖는 유전자 쌍은 신진 대사 네트워크 허브를 구성하기 위해 공동 진화하였으며 광합성 및 비광합성 네트워크 허브 간의 구별을^44로만들 수 있다. 일반적으로 광합성 네트워크 허브(예: 모델의 고도로 연결된 노드)는 이종성 모델에서 제외됩니다. 실용적인 목적을 위해, mixotrophic 종에서 이종성 위를 모델링하는 것은 빛에 의해 구동되는 것으로 알려진 반응을 생략하고 조건 간의 에너지 균형 차이를 설명해야합니다. 따라서, 빛에 의존적이고 가벼운 독립적인 신진대사를 모델링하는 것은 클라미도모나스 대사 모델링^6,45에서표준 관행이다.

Trebouxiophytes 같이 몇몇 녹색 미세조류는, 성장을 위한 탄소 분자의 다양한 동화하기 위하여 알려지고, 이것은 lichens의 일원으로 그들의 긴 진화 역사에서 생겨난 것으로 생각됩니다^46. 클라미도모나스와 같은 엽록소는 성장을 위해 아세테이트를 사용할 수 있지만, 매우 긴 사슬의 고도 불포화 지방산(VLC-PUFA)을 상업적으로 생산할 수 있는 잠재력으로 알려진 갈색 해양 미세알가 티조크리시스 루테아는 아세테이트를 사용할 수 없지만^47년성장을 위해 글리세롤을 사용할 수 있다. 100g^l-1 건조 세포 중량의 바이오매스 농도는 공급 배치 모드^48에유기 탄소 원을 최적화한 첨가와 함께 클로렐라로 달성되었다. 또한, 클로렐라불가리에 설탕을 첨가하면_CO2의 격리를 촉진하여 광합성 성장 시 첨가제 혜택을 제공할 수^있다(49). 대부분의 이종국형 미세조류는 혼합형으로 성장할 수 있지만, 엽록토 염색체 소포링기엔시스는 설탕^50을첨가하면 광합성을 차단하는 것으로 나타났다.

디아톤, 분열 바실라리오피타에 속하는, 식물성 플랑크톤의 주요 그룹입니다. 대부분의 투이음은 광토영양적으로만 성장할 수 있지만, 그 중 일부는 혼합또는 이종성^51을재배할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 모델 종 Phaeodactylum tricornutum(52)을포함하는 일부 규음에서_CO2가 없는 상태에서 빛의 성장을 지원하는 것으로 나타났다. 또한, 니츠치아 리니시스와 같은 일부 벤딕 규격은 어두운^53에서탄수화물에서 자랄 수 있다. 세포가 이종성으로 성장할 수 있도록 적절한 유기 탄소 원을 보충함으로써 PM 측정기 및 기타 조류 그룹에 PM 애서를 확장할 가능성이 있으며, 혼합 측위 전략은 최소한의 필수 광 공급을 제공하는 의무 적인 자가 영양축미세 조류에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

데이터의 재현성을 평가하기 위해 모든 플레이트에 대해 중복 분석방법을 수행하는 것이 좋습니다. 분석은 음의 제어 및 각각의 빈 우물에서 빼낸 후, 흡광도(PMI 값)가 양성인 경우에만 양성으로 간주될 수 있다. 이 설명은, 시험된 화합물의 존재에서, 염료의 생체 내 반응을 배지와 반영한다.

Materials

Ampicillin	VWR	97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]	Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog Instrument	Biolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503	Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.		Regents of the University of Minnesota
Kanamycin	VWR	0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”	Biolog, Hayward, CA, USA
Timentin	GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd	42010012-2