Metabolisk profilering med hög genomströmning för modellförbättringar av mikroalger

Summary

Detta protokoll visar användningen av en fenotyp microarray (PM) teknik plattform för att definiera metaboliska krav av Chlamydomonas reinhardtii, en grön microalga, och förfina en befintlig metabolisk nätverksmodell.

Abstract

Metaboliska modeller rekonstrueras baserat på en organisms tillgängliga genomanotering och ger prediktiva verktyg för att studera metaboliska processer på systemnivå. Genomskalade metaboliska modeller kan inkludera luckor samt reaktioner som är overifierade experimentellt. Rekonstruerade modeller av nyligen isolerade mikroalgala arter kommer att resultera i svagheter på grund av dessa luckor, eftersom det vanligtvis finns glesa biokemiska bevis tillgängliga för metabolismen av sådana isolat. Fenotypmikroarray (PM) teknik är en effektiv, hög genomströmning metod som funktionellt bestämmer cellulära metaboliska aktiviteter som svar på ett brett spektrum av inträde metaboliter. Kombinera hög genomströmning fenotypiska analyser med metabolisk modellering kan göra det möjligt för befintliga metaboliska nätverksmodeller att snabbt rekonstrueras eller optimeras genom att tillhandahålla biokemiska bevis för att stödja och expandera genomiska bevis. Detta arbete kommer att visa användningen av PM-analyser för studier av mikroalger genom att använda den gröna mikroalgala modellarten Chlamydomonas reinhardtii som exempel. Experimentella bevis för över 254 reaktioner erhållna av PM användes i denna studie för att expandera och förfina en genomskala C. reinhardtii metabolisk nätverksmodell, iRC1080, med cirka 25 procent. Protokollet som skapas här kan användas som grund för funktionell profilering av metabolismen av andra mikroalger, inklusive kända mikroalgermutanter och nya isolat.

Introduction

Optimering av algmetabolism för förbättrad och stabil produktion av riktade metaboliter kräver utveckling av komplexa metaboliska tekniska strategier genom systemnivåanalyser av metaboliska nätverk. Metaboliska nätverksmodeller kan vägleda de rationella designerna för snabb utveckling av optimeringsstrategier^1,2,3,4. Även om cirka 160 mikroalgala arter har^{sekvenserats 5}, finns det enligt vår kunskap endast 44 algmetaboliska modeller tillgängliga^4,6,7. På grund av svårigheten att erhålla metaboliska fenotypiska data med hög genomströmning för experimentell validering av genomisk information ligger återuppbyggnaden av högkvalitativa nätverksmodeller efter den snabba utvecklingen av alggenomsekvensering.

C. reinhardtii är ett attraktivt modellsystem för algbaserade studier. Denna art kan växa fotoautotrophically eller heterotrophically och har använts i stor utsträckning som en modellorganism i grundläggande och tillämpad forskning. Dess genomsekvens publicerades 2007⁸, med genomskalade metaboliska modeller som senare rekonstruerades för arten^9,10,11. Genomskalan för C. reinhardtii (iRC1080) rekonstruerades av Chang et al. ¹⁰ baserat på genomiska och litteraturbevis (med ~250 källor). Den har 1 706 metaboliter med 2 190 reaktioner^10; Modellens fullständighet kunde dock inte kontrolleras utöver de tillgängliga offentliggjorda experimentella bevisen vid den tidpunkten.

Fenotypmikroarrays (PMs) teknik är en plattform med hög genomströmning som kan ge metabolisk profileringsinformation för heterotrofa mikroorganismer samt vävnadskulturceller. I synnerhet kan det användas för att ta itu med kunskapsgapet fenotyp till genotyp i mikroalger, som först rapporterades för Chlamydomonas reinhardtii¹² och därefter för en art av kloroidium¹³ och Chlorella¹⁴. Genom att studera cellsvar på tusentals metaboliter, signalmolekyler, osmolyter och effektormolekyler kan PM-analyserna ge funktionell metabolisk profilering och ge insikter om funktion, metabolism och miljökänslighet^15,16,17. Specifikt detekterar PM-analyser cellers metabolitanvändning i 96-brunns mikroplattor med olika näringsämnen, metaboliter eller osmolyter som finns i varje brunn. Dessutom är det också möjligt att analysera bioaktiva molekyler, såsom antibiotika och hormoner. Som bestäms av färgproduktionens intensitet genom NADH-reduktionen av ett tetrazoliumbaserat redoxfärgämne utvärderas det metaboliska utnyttjandet av substrat i termer av cellandning^15,16,17. Experimenten i 96-brunnsmikroplattor kan övervakas och bestämmas automatiskt över tid med plattformen för fenotypmikroarrayinstrument (PMI). Tjugo 96-brunns mikroplattor är utformade för att representera de vanliga uppsättningen metaboliter för att studera cellulära fenotyper för att använda kol-, kväve-, svavel- och fosforkällor, tillsammans med olika osmotiska / jon- och pH-effekter. PM-tekniken har framgångsrikt använts för att uppdatera och uppgradera ett antal befintliga genomskalade metaboliska modeller för mikroorganismer^15,16,17,18.

Protokollet och data som visas här är baserade på tidigare publicerade verk av Chaiboonchoe et al. ¹² Det presenterade arbetet beskriver användningen av PM-analysmetoden för att karakterisera de metaboliska fenotyperna av mikroalger och för att utöka en befintlig algmetabolisk modell av C. reinhardtii samt för att vägleda återuppbyggnaden av nya metaboliska modeller.

Protocol

1. Phenotype Microarray Experiment Få C. reinhardtii stam CC-503 från Chlamydomonas Resource Center vid University of Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org). Odla cellerna i färska Tris-Acetat-Fosfat (TAP) media19 med slutliga koncentrationer av 400 μg/mL timentin, 50 μg/mL ampicillin och 100 μg/mL kanamycin (för att hämma bakterietillväxt) under 400 mikromol fotoner/m2s, vid 25 °C, i två dagar till mitten av stockfasen. Snurra ner kulturen vid 2 000 x g i 10 min vid 22 °C och kassera supernatanten utan att störa pelleten. Förbered färska TAP-medier som innehåller 0,1% tetrazoliumviolett färgämne “D”.OBS: Ändra TAP-media i detta steg för att utesluta vissa näringsämnen beroende på den metabolitkategori som testas i varje platta (t.ex. uteslut ammoniumklorid för kvävekällaplattor). Återsuspendera pelleten i färska TAP-medier beredda (från steg 1.2) till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml. Använd kemiska sammansatta matrisanalysplattor (kolkällor, kvävekällor, fosfor- och svavelkällor och peptidkvävekällorna). Inokulera en 100 μL alikvot cellinnehållande media i varje brunn på analysplattorna.OBS: Se till att duplicera analyserna. Strimmor på jästextrakt/peptonplattor och utför gramfärgning, som i Smith m.fl. 20 före och efter analysen för att övervaka bakteriell förorening. För in de kemiska sammansatta matrisanalysplattorna i mikroplattans avläsarsystem. Inkubera alla plattor vid 30 °C i upp till 7 dagar och programmera mikroplattans avläsarsystem att läsa färgförändringen var 15:e minut.OBS: Eftersom de flesta mikroplatta läsare inte ger en källa till kontinuerligt ljus under inkubation, algerna bör kunna utföra heterotrofisk andning. 2. Dataanalys Exportera de råa kinetiska data från mikroplateläsaren som CSV-filer, som därefter kommer att användas som indata till Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -paketet i R. Lägg till den biologiska informationen som metadata (t.ex. stambeteckning, tillväxtmedier, temperatur etc.). Använda PM Kinetic datakonverterare programvara; läs in D5E-datafilerna och konvertera dem till OKA-filer med hjälp av följande kommandorader i PM kinetiska analysprogramvaran:Läs in | Importera (leta reda på mappen för OKA-filerna) | Fyll filter | Importera | Lägg till alla tallrikar | Stänga.Exportera | välj läsdata (Kinetic), välj format (CSV) (tabulthuvud)och välj skyltar (varje platta (enskilda filer)) | Exportera data | Spara. För att utföra Phenotype Microarray (PM) dataanalys, använd OPM-programvarupaketet21,22 som körs i R-programvarumiljön. Paketet, självstudien och referensdokumentationen finns på: http://www.goeker.org/opm/. I RStudio, ett grafiskt användargränssnitt för R, installerar du opm-paketet och dess beroenden med följande kommandon:källa (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)bibliotek (opm) Navigera till katalogen som innehåller CSV-filerna för kinetiska data och importera data med hjälp av funktionen read_opm: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:")) Aggregera och diskretisera kinetiska data med hjälp av uppskattning av kurvparameter.För (i i 1 :length(x)) {x[i]] <Jag gör _aggre(x[i]], boot = 0 L, kärnor = 1 L, metod ="splines", alternativ = set_spline_options("smooth.spline"))x[i]] <- do_disc(x[i]], cutoff = FALSE)}#Collection metadatametadata <- collect_template(".)metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503")för (I i 1:length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)} Använd funktionen xy_plot för att kartlägga andningsmätningarna (eller tillväxtmätningarna) (y-axeln) som en funktion av tid (x-axel) för de belagda 96-brunnsplattorna.skriva ut (xy_plot(x[[ 1 ]], inkludera =”Stam”, teor.max = FALSKT)) Visualisera data som en värmekarta med hjälp av funktionen level_plot för att möjliggöra en snabb jämförande översikt över de kinetiska data.level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt(“color.borders”), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =” “, space =”Lab”, bias = 0,7 , num.colors = 200 L) Extrahera viktig biologisk information, kurvparametrarna, från de råa kinetiska kurvorna och inkludera fördröjningsfasen (λ), tillväxthastigheten (μ), maximal cellandning (A) och området under kurvan (AUC)21. För att identifiera positiva metaboliter, använd A-värdena för den negativa kontrollen, som representerar färgämnets abiotiska reaktivitet med mediet, förutom luckan för varje mikrobrunnplatta som bakgrundsretraktionsvärden. Extraktfunktionen används för att hämta A-parametern.opm_opt(“curve.param”)param <- extrakt (x, as.labels = list("Stam"))) 3. Identifiering av reaktioner och gener associerade med nya metaboliter Sök i KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) och MetaCyc (http://metacyc.org/) för att identifiera enzymkommissionens nummer (ECs) för reaktioner med hjälp av metaboliter som finns från kemiska sammansatta matriser23,2423,24. Använd de identifierade EG-numren som sökunderlag i flera tillgängliga algnotationsresurser som Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) och peer-reviewed publikationer23,25,26,27. Om en fråga inte returnerar några genetiska bevis för ett visst EG-nummer, identifiera relevanta associerade proteiner i andra organismer, med början med arter närmast C. reinhardtii, utför sedan en profilbaserad sökning med NCBI PSI-BLAST-servern med standardinställningar och använd icke-redundanta proteiner (nr) i C. reinhardtii (taxid:3055) för att identifiera kandidatgener som är associerade med reaktionen12. Kurera PSI-BLAST-träffar manuellt med E-värden på < 0,05 för relevans för det sökta EG-numret genom att fråga dessa BLAST-träffar via EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) eller InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) proteindomänförutsägelseservrar. Observera att de två senare skanningarna är kritiska steg för att säkerställa identifieringen av rätt enzymatisk aktivitet för proteinet. 4. Modellförfining och utvärdering Använd den senaste COBRA Toolbox v.3.028i MATLAB29,30plattform för att utföra följande steg för modellförfining. COBRA Toolbox kan installeras genom att följa stegen i: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativt kan du notera att COBRA Toolbox också implementeras över andra programmeringsspråk med öppen källkod, till exempel Python (COBRApy31) och finns på: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .När du har installerat COBRA Toolbox v.3.0 öppnar du MATLAB och kör följande kommando för att initiera verktygslådan:initCobraToolbox; Lägg till de identifierade reaktionerna med tillhörande gener till den metaboliska modellen, till exempel iRC1080, med hjälp av COBRA Toolbox-funktionerna addReaction och changeGeneAssociation. Navigera till katalogen som innehåller iRC1080-modellen, hämtas från http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 och kör följande kommandon för att läsa in modellen, byta namn på den och lägga till en ny reaktion och dess associerade gen.Belastning(‘iRC 1080 .mat’)modelNew = iRC 1080;modelNew = addReaction(modelNew, ‘D-ALA 2’, …{‘d-ala[c]’ , ‘atp[c]’ , …”D-aladata[c]” , “adp[c]” , “pi[c]” , …”h[c]’ },[- 2 – 1 1 1 1 1 ],false);modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, …D-ALA 2, a.g 14655 _t 1). I vissa fall när metaboliten inte produceras intracellulärt utan tas upp från mediet, tillsätt transportreaktioner för de nya metaboliterna till modellen. Dessa transportreaktioner representerar passiv diffusion av en metabolit från det extracellulära mediet till cytosolen. Lägg dessutom till en motsvarande artificiell utbytesreaktion med hjälp av funktionen addExchangeRxn för att mata in eller mata ut metaboliten i det extracellulära mediet.modelNew = addReaction(modelNew, ‘CYCPt’ , …{‘cycp[e]’,’cycp[c]’ },[- 1 1 ],true)’modelNew = addExchangeRxn(modelNew, ‘cycp[e]’ ,- 1000 ,1000 ); Testa beteendet hos den nya resulterande modellen, t.ex. iBD1106, genom att utföra flödesbalansanalys (FBA) med hjälp av funktionen optimizeCbModel under ljusa och mörka förhållanden för maximering av biomassa som objektiv funktion. För ljus tillväxt, ställ in de nedre och övre gränserna för PRISM solar lithos ljusreaktioner på 646,07 (maximal hastighet). För mörk tillväxt ställer du in gränserna för alla PRISM-ljusreaktioner på noll. Använd funktionen Biomassa som tidigare definierats10 för tillväxt under mörka och ljusa förhållanden. FBA-lösningen kommer att producera två vektorer som motsvarar reaktionsflöde (solution.v) och minskad kostnad (solution.w), samt en vektor som motsvarar metaboliternas skuggpriser (lösning.y).%Simulera tillväxt i ljust skick:modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ …% “PRISM_solar_litho”, …”PRISM_solar_exo”, …”PRISM_incandescent_ 60 W” …”PRISM_fluorescent_cool_ 215 W” , …”PRISM_metal_halide”, …”PRISM_high_pressure_sodium” …”PRISM_growth_room”, …”PRISM_white_LED” …”PRISM_red_LED_array_ 653 nm”, …”PRISM_red_LED_ 674 nm”, …”PRISM_fluorescent_warm_ 18 W” …”PRISM_design_growth”, …}, 0, “b” ).modelNew = changeObjective(modelNew, ‘BIOMASS_Chlamy_mixo’);FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, ‘max’); Upprepa steg 4.1.4 för iRC1080 för att jämföra FBA-lösningar som erhållits för iBD1106 med de som erhållits för iRC1080. Det finns en rad COBRA-metoder tillgängliga som kan användas för att jämföra modeller (t.ex. flödesvariationsanalys, genborttagningsstudier, robusthetsanalyser, fluxdelningsprognoser, FBA, provtagning etc.). Detaljerade handledningar finns på https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Här ges ett exempel där iRC1080-modellen jämförs med dess raffinerade version, iBD1106, genom att erhålla skuggpriserna (känsligheten hos biomassamålfunktionen för förändringar i systemvariabeln) för de metaboliter som redovisas i varje modell.Få skuggpriserna för metaboliterna:shadowPrices = table(modelNew.mets, …modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Representative Results

Fenotyp Microarray screening av modell alga Chlamydomonas reinhardtiiPM-analyserna testar algens förmåga att använda olika källor till kol, kväve, svavel och fosfor i ett minimalt medium. I denna metodbeskrivning visade vi hur PM-analyser användes för att identifiera kol- och kvävemetabolism. Kol- och kväveutnyttjande kinetik mättes med en mikroplatta läsare. Data analyserades med hjälp av PMI-programvara. Sammanfattningen av kinetiken för valda PM-analysplattor (PM01 och PM03) visas i figur 1. “Xy-diagram” visar de andningsmätningar över tid som ritats för 96-brunnsplattornas analyser, där y-axeln och x-axeln representerar värdena för råa mätningar respektive tid. Data konverterades till ett värmekartmönster för att jämförelsevis analysera sammansättningen av kinetiska data. Pipelinen för raffinering genomskala metaboliskt nätverk med hjälp av PM-data (figur 2) illustrerar integrationen av pm-analyser med hög genomströmning med experimentella bevis som tillhandahålls av genomiska sökningar kan expandera en metabolisk nätverksmodell. För att bestämma reproducerbarheten av PM-data som erhållits från PM01 – 04 och PM10-plattor analyserades en linjär regression för att plotta data från två oberoende replikera experiment mot varandra (figur 3). Figur 3 visar att majoriteten av uppgifterna var nästan lika eftersom de faller på 45°-linjen, med endast ett fåtal avvikande värden närvarande, och deras bestämningskoefficient R2 var 0,9. Konsekvensen och reproducerbarheten hos experimenten för algen verifieras av denna tavla. Identifiering av nya metaboliterPM-analysen identifierade 662 metaboliter i sju plattor; PM01-PM04 och PM06-PM08, medan gaskromatografi time-of-flight (GC-TOF) hade identifierat 77 metaboliter32 (figur 4). När man jämförde dessa två uppsättningar med de 1068 metaboliter som anges i iRC1080 överlappade endast sex metaboliter mellan de tre uppsättningarna och 149 överlappade mellan iRC1080 och PM. Detta resultat visar att den metaboliska profileringsplattformen kan vara en betydande källa till ny metabolisk information. Ättiksyra var den enda kolkällan som upptäcktes i platta PM01 som ett stödjande kol efter att ha subtraherat bakgrundssignalen. Detta konstaterande överensstämmer med litteraturen33 och visar specificiteten i PM analyser. PM-analyserna visade nya svavel-, fosfor- och kvävekällor som C. reinhardtii kan använda för tillväxt. Svavel metaboliterna var sulfat, tiosulfat, tetrathionate och DL-Lipoamide. Fosfor källorna var tiophosphate, dithiophosphate, D-3-phospho-glyceric syra och cysteamin-S-fosfat. Kvävekällan metaboliter var L-amino och D-aminosyror, inklusive mindre vanliga aminosyror; L-homoserin, L-pyroglutamic, metylamin, etylamin, etanolamin och D,L-α-amino-butyric, och 108 Di-peptider och fem Tri-peptider(tabell 1). Alla de 128 nyligen identifierade metaboliterna söktes i KEGG och MetaCyc för deras associerade reaktioner, EC-nummer och vägar. De nya 128 metaboliterna var associerade med 49 unika EG-nummer. Av dessa var 15 ECs kopplade till deras genomiska bevis med hjälp av fem källor, inklusive; Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0 och 5.210 anteckningar från Manichaikul et al. 36 och KEGG13. Metaboliter utan genomiska bevis skrevs in på Universal Protein Resource webbplats (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 där deras relaterade sekvenser hittades i andra organismer. Homologa sekvenser i C. reinhardtii identifierades genom att köra position-specifika itererade BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) från NCBI:s webbplats med tanke på endast sekvenser som producerade betydande justeringar (E-värde <0.005). ModellförfiningReaktioner associerade med de nya 128 metaboliterna, tillsammans med deras kodade gener, lades till iRC1080-modellen, vilket utökade nätverket. Den resulterande modellen iBD1106 står för 2 444 reaktioner, 1 959 metaboliter och 1 106 gener (tabell 2). De nya 254 tillsatta reaktionerna var 20 aminosyraoxidationsreaktioner, 108 dipeptidhydrolysreaktioner, fem tripeptidhydrolysreaktioner och 120 transportreaktioner, kodade av fyra gener (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3). Totalt 113 tillsatta nya reaktioner står för hydrolys av dipeptider och tri-peptider. Hydrolysen av dipeptider och tri-peptider är associerad med två gener, en för dipeptider (Cre02.g078650.t1.3) och en för tri-peptider (Cre16.g675350.t1.3). När det gäller källor till fosfor tillsattes en reaktion för hydrolys av cysteamin-S-fosfat i cysteamin och fosfat i samband med genen JLM_162926. WoLF PSORT-verktyget39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) och resultat som rapporterats av Ghamsari et al. 35 tillämpades för att erhålla specifikationen av de cellulära fack där de nya reaktionerna äger rum. Genom att analysera proteinsekvenser i samband med de nya reaktionerna förutspådde WoLF PSORT cytosol som cellfack för reaktionerna. En genererad metabolisk modell kan innehålla luckor när den biokemiska informationen är ofullständig. I sådana fall används gapFind, ett COBRA-kommando. Den listar rotluckor och gör det möjligt att identifiera nya luckor introduktion i den nya modellen. De metaboliter som inte kan produceras i en metabolisk modell kallas rotluckor40,41. Att analysera rotgapet indikerade att både iRC1080 och iBD1106-modellerna innehåller samma 91 luckor. Detta visar att lägga till de nya metaboliterna och deras associerade reaktioner inte införa några ytterligare rotluckor. Det bör noteras att den fenotypningsmetod som används i detta protokoll inte tär rotluckorna, eftersom de ursprungliga rotgapmetaboliterna saknar transport- eller produktionsmekanismer, som inte togs upp i fenotypningsanalyserna. Flux balans analys utfördes för att testa det metaboliska beteendet hos iBD1106 under ljusa och mörka förhållanden; (inget acetat) respektive (med acetat). Algoritmen maximerar biomassaprekursorreaktionerna för en objektiv funktion (biomassatillväxt). För att utvärdera varje metabolits inblandning i den inställda objektiva funktionen beräknades “skuggpriser” för alla metaboliter. Förändringen i den objektiva funktionen när det gäller flödesförändringar av metaboliten definierar skuggpriset för en metabolit30,42. Indikationen på om en metabolit är “överdriven” eller “begränsar” den objektiva funktionen kan bestämmas genom skuggprisanalys, t.ex. Negativa eller positiva skuggprisvärden avslöjar metaboliter som vid tillägg kommer att minska eller öka den objektiva funktionen. Nollvärden för skuggpriser avslöjar metaboliter som inte påverkar den objektiva funktionen. Jämförelsen av skuggpriserna mellan iBD1106 och iRC1080 i figur 5 visar att för de flesta metaboliter observeras ingen betydande förändring. skillnader finns dock i 105 respektive 70 fall under ljusa respektive mörka tillväxtförhållanden. Tabell 4 innehåller exempel på sådana metaboliter. Figur 1: Fenotypisk mikroarrayprofilering av C. reinhardtii. Andning XY-tomter och nivå tomter i PM01 (Kolkällor; A, C) och PM03 (kvävekällor; B, D) analysplattor visas. Siffran är en 8×12-matris där varje cell representerar en välplatta och därmed en given metabolit eller tillväxtmiljö. Inom varje cell eller brunnsrepresentation representerar kurvor färgkonvertering genom reduktion (y-axel) som en funktion av tid (x-axel). PM-andningskurvor från CC-503 och tomma brunnar visas i varje cell och indikeras av färg (krickafärg representerar tomma brunnar och lila färg representerar CC-503). Nivådiagrammet representerar varje andningskurva som en tunn vågrät linje som ändrar färg (eller förblir oförändrad) över tid. Värmekartans färgförändringar är från ljusgula (liten eller ingen andning har ägt rum) till mörkorange eller brun (betydande andning har ägt rum). Metaboliter som används av C. reinhardtii (CC-503) och de tomma plattorna visas. Denna siffra är från ett tidigare publicerat verk av Chaiboonchoe et al. 12Klicka här för att se en större version av denna siffra.  Figur 2: Genomskalad metabolisk nätverksförfiningspipeline med hjälp av PM-data. Efter en ny förening testar positivt i en PM-analys, dess enzymkommissionen nummer (EG), reaktion, och väg identifieras från tillgängliga databaser, t.ex. KEGG och MetaCyc. Genomiska bevis extraheras sedan från genomiska och anteckningsresurser när de är tillgängliga och utgör en länk mellan genotyp och fenotyp. När direkta genomiska bevis inte är tillgängliga identifieras proteinsekvensen från EG-numren och genetiska bevis identifieras via PSI-Blast. Det rekonstruerade metaboliska nätverket förfinas sedan baserat på nyligen identifierade föreningar, men först efter ett kvalitetskontrollsteg som innebär att man frågar proteindomänerna med hjälp av relevanta databaser. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade verk av Chaiboonchoe et al. 12Klicka här för att se en större version av denna siffra.  Figur 3: Reproducerbarhet av PM-tester. PMI-värdena samlades in under en 168-timmarsperiod och de maximala PMI-värdena ritades upp för två replikatstudier. Varje axel representerar de maximala PMI-värdena för varje studie (x-axeln är en replikerad studie och y-axeln en annan). Reproducerade värden är lika med varje axel. Varje punkt representerar ett enda maximalt värde. Den linjära regressionen utfördes av ett kalkylbladsprogram, och den resulterande bestämningskoefficienten (R2) visas. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade verk av Chaiboonchoe et al. 12Klicka här för att se en större version av denna siffra.  Figur 4: Venndiagram över metaboliter. Venndiagrammet räknar upp metaboliter som identifieras av PM-plattor, den metaboliska modellen iRC1080 och GC-TOF-experiment (Gas Chromatography Time of Flight). Varje cirkel anger det totala antalet metaboliter som finns i respektive studiemetod. Samtidigt representerar de överlappande regionerna det antal metaboliter som delas mellan dessa metoder. Den metaboliska modellen iRC1080 innehåller totalt 1 068 unika metaboliter. GC-TOF identifierade totalt 77 metaboliter32, medan det finns totalt 662 metaboliter identifierade med hjälp av PM-plattorna. Denna siffra är från tidigare publicerat arbete av Chaiboonchoe et al. 12Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Skuggpriser på metaboliter i iRC1080 och iBD1106 under olika förhållanden för maximering av biomassa. Varje cirkel på “radarområdena” motsvarar ett skuggprisvärde, medan varje linje som sträcker sig från mitten av ett område indikerar en metabolit. A) Skuggpriser och metaboliska beteenden hos iRC1080 och iBD1106 under ett lätt tillväxtförhållande. (B), olika metaboliska beteenden hos iRC1080 och iBD1106 under ett mörkt tillväxttillstånd. Denna siffra är från tidigare publicerat arbete av Chaiboonchoe et al. 12Klicka här för att se en större version av denna siffra. Biolog kemisk EG* Genkommentar PSI-BLAST Cysteamin-S-fosfat 3.1.3.1 JLM_1629261,2,3,4 Tetrathionat 1.8.2.2 obetydligt E-värde 1.8.5.2 obetydligt E-värde D-Alanin 1.4.1.1 XP_001700222.1 1.5.1.22 misslyckade manuella QC 2.1.2.7 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 2.3.2.10 obetydligt E-värde 2.3.2.14 obetydligt E-värde 2.3.2.16 obetydligt E-värde 2.3.2.17 obetydligt E-värde 2.3.2.18 obetydligt E-värde 2.6.1.21 misslyckade manuella QC 3.4.13.22 XP_001698572.1 XP_001693532.1 XP_001701890.1 XP_001700930.1 3.4.16.4 Chlre2_kg.ställning_ 140000391,2,3 3.4.17.8 misslyckade manuella QC 3.4.17.13 obetydligt E-värde 3.4.17.14 obetydligt E-värde 4.5.1.2 obetydligt E-värde 6.1.1.13 misslyckade manuella QC 6.1.2.1 misslyckade manuella QC 6.3.2.4 au.g14655_t11,2,3 6.3.2.10 misslyckade manuella QC 6.3.2.16 obetydligt E-värde 6.3.2.35 obetydligt E-värde D-Asparagine 1.4.5.1 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 3.1.1.96 obetydligt E-värde 2.3.1.36 obetydligt E-värde 1.4.99.1 XP_001692123.1 3.5.1.77 e_gwW.1.243.11,2 3.5.1.81 obetydligt E-värde 5.1.1.10 misslyckade manuella QC D-aspartsyra 6.3.1.12 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-glutaminsyra 1.4.3.7 obetydligt E-värde 1.4.3.3 obetydligt E-värde D-Lysin 5.4.3.4 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 6.3.2.37 misslyckade manuella QC D-Serine 2.7.11.8 obetydligt E-värde 2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31,2,3,4 3.4.21.78 misslyckade manuella QC 3.4.21.104 misslyckade manuella QC 4.3.1.18 g6244.t14 misslyckade manuella QC 6.3.2.35 obetydligt E-värde 6.3.3.5 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-Valine 1.21.3.1 misslyckade manuella QC 6.3.2.26 misslyckade manuella QC 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 L-pyroglutamsyra Tiofosfat Dithiofosfat Etylamin 6.3.1.6 D,L-a-Amino-smörsyra 2.1.1.49 obetydligt E-värde 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 Di-peptid 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31 Tri-peptid 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31 Tabell 1: Förteckning över identifierade metaboliter för positivt substrat (C, P, S, N) som inte finns i den metaboliska modellen iRC1080.   *Reaktion inkluderades inte om ingen gen identifierades.  1 Phytozome version 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI version 4 35.  3 Augustus version 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI version 3.136.  Denna tabell är från tidigare publicerat verk av Chaiboonchoe et al. 12 Modell Reaktioner Metaboliter Gener iRC1080 2,191 1,706 1,086 iBD1106 2,445 1,959 1,106 Tabell 2: Innehållet i iRC1080 och iBD1106.  Denna tabell är från tidigare publicerat verk av Chaiboonchoe et al. 12 Kategori eller klass av reaktioner Antal reaktioner Aminosyror 20 Dipeptider 108 Tripeptider 5 Transportreaktion 120 Tabell 3: Sammanfattning av nya reaktioner i IBD1106. Denna tabell är från tidigare publicerat verk av Chaiboonchoe et al. 12 Tillväxttillstånd Metabolit Namn iRC1080 iBD1106 4r5au 4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracil 0 0.168 5aprbu 5-Amino-6-(5′-fosforibitylamino)uracil -0.009 0.158 Ljus pa1819Z18111Z 1-(9Z)-octadecenoyl,2-(11Z)-octadecenoyl-sn-glycerol3-fosfat -0.009 -0.65 Mörk 4abut 4-aminobutanoat 0.18 -0.05 Tabell 4: Exempel på betydande skuggpriser för iRC1080 och iBD1106. Denna tabell är från tidigare publicerat verk av Chaiboonchoe et al. 12

Discussion

Metabolisk fenotypning av den gröna microalga, C. reinhardtii, beskrevs här med hjälp av hög genomströmning PM analys plattor och en oförändrad PMI. Testerna användes för totalt 190 kolkällor (PM01 och PM02), 95 kvävekällor (PM03), 59 fosforkällor och 35 svavelkällor (PM04), tillsammans med peptidkvävekällor (PM06-08). Positiv andning observerades för 148 näringsämnen (en positiv analys för användning av C-källor, fyra positiva analyser för varje användning av S-källan och P-källan och 139 positiva analyser för användning av N-källor). Mediets substrat eller näringsämnen (kol, kväve, fosfor eller svavel) bör inte tillsättas det definierade mediet när de appliceras på de relevanta PM-mikroplattor som testar för var och en av dessa källor.

Metoden som visas här är effektiv för att karakterisera metaboliska mikroalgerfenotyper som kan användas för att utöka befintliga metaboliska nätverksmodeller eller styra återuppbyggnaden av nya modeller. Vidare, eftersom näringsbehoven hos de flesta mikroalger inte är kända, kan denna plattform användas för att definiera dessa snabbt. Nelson et al. ⁴³ hade framgångsrikt tillämpat dessa metoder för att identifiera nya föreningar som stöder tillväxten av mikroalger Chloroidium sp. UTEX 3007 och använt den erhållna informationen för att definiera artinträdemetaboliter, som till skillnad från Chlamydomonas omfattar 40 olika kolkällor.

En viktig begränsning av pm för profilering av mikroalger är att PMI inte har någon belysning i inkubationskammaren, och mikroalger måste kunna utföra heterotrofisk metabolism. Frånvaron av ljus kan påverka tolkningen av modeller som innehåller ljus för att beräkna metaboliska flöden. Genpar med koordinerande funktioner har utvecklats tillsammans för att utgöra metaboliska nätverkshubbar, och skillnaden mellan fotosyntetiska och icke-fotosyntetiska nätverkshubbar kan göras⁴⁴. I allmänhet skulle fotosyntetiska nätverkshubbar (dvs. höganslutna noder i modellen) utelämnas från heterotrofa modeller. För praktiska ändamål bör modellering av heterotrofiism hos mixotrofiska arter utelämna reaktioner som är kända för att drivas av ljus och ta hänsyn till energibalansskillnaderna mellan förhållandena. Således är modellering av ljusberoende och ljusoberoende metabolism standardpraxis i Chlamydomonas metabolisk modellering^6,45.

Vissa gröna mikroalger, som Trebouxiophytes, är kända för att assimilera en mängd olika kolmolekyler för tillväxt, och detta tros ha uppstått från deras långa evolutionära historia som medlemmar i lavar⁴⁶. Medan klorofyller som Chlamydomonas kan använda acetat för tillväxt, den bruna marina mikroalga Tisochrysis lutea, känd för sin potential att kommersiellt producera mycket långkedjiga fleromättade fettsyror (VLC-PUFAs), kan inte använda acetat men kan använda glycerol för tillväxt⁴⁷. Biomassakoncentration på mer än 100 g l⁻¹ torrcellsvikt har uppnåtts med Chlorella med optimerad tillsats av organiska kolkällor i fed-batch-läge⁴⁸. Vidare kan tillsats av socker till Chlorellavulgaris höja dess bindning av CO_2, vilket ger en additiv fördel under fotosyntetisk tillväxt⁴⁹. De flesta heterotrofa mikroalger kan också växa mixotrohically, men klorofyllen Chromochloris zofingiensis har visat sig stänga av fotosyntes vid tillsats av socker⁵⁰.

Diatomer, som tillhör divisionen Bacillariophyta, är en stor grupp fytoplankton. Även om de flesta diatomer bara kan växa fotoautotrophically, kan några av dem odlas mixotrophically eller heterotrophically⁵¹. Till exempel, glycerol konstaterades stödja tillväxt i ljuset i avsaknad av CO₂ i vissa kiselalger, inklusive modellarten Phaeodactylum tricornutum⁵². Vissa benthic diatoms som Nitzschia linearis kan också växa på kolhydrater i mörkret⁵³. Det är sannolikt att utvidga PM-analyserna till diatomer och andra alggrupper genom att komplettera lämpliga organiska kolkällor för att cellerna ska kunna växa heterotrofiiskt, och en mixotrofistrategi kan också potentiellt användas för den obligatoriska autotrofiska mikroalger som ger en minimalt nödvändig ljustillförsel.

För att bedöma uppgifternas reproducerbarhet rekommenderas det starkt att duplicerade analyser utförs för alla plattor. En analys kan endast anses vara positiv om absorbansen (PMI-värdet) är positiv efter subtraktion från den negativa kontrollen och respektive blanka brunnar. Denna beskrivning, i närvaro av den testade föreningen, är en återspegling av färgämnets abiotiska reaktion med mediet.

Materials

Ampicillin	VWR	97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]	Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog Instrument	Biolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503	Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.		Regents of the University of Minnesota
Kanamycin	VWR	0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”	Biolog, Hayward, CA, USA
Timentin	GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd	42010012-2