Detta protokoll visar användningen av en fenotyp microarray (PM) teknik plattform för att definiera metaboliska krav av Chlamydomonas reinhardtii, en grön microalga, och förfina en befintlig metabolisk nätverksmodell.
Metaboliska modeller rekonstrueras baserat på en organisms tillgängliga genomanotering och ger prediktiva verktyg för att studera metaboliska processer på systemnivå. Genomskalade metaboliska modeller kan inkludera luckor samt reaktioner som är overifierade experimentellt. Rekonstruerade modeller av nyligen isolerade mikroalgala arter kommer att resultera i svagheter på grund av dessa luckor, eftersom det vanligtvis finns glesa biokemiska bevis tillgängliga för metabolismen av sådana isolat. Fenotypmikroarray (PM) teknik är en effektiv, hög genomströmning metod som funktionellt bestämmer cellulära metaboliska aktiviteter som svar på ett brett spektrum av inträde metaboliter. Kombinera hög genomströmning fenotypiska analyser med metabolisk modellering kan göra det möjligt för befintliga metaboliska nätverksmodeller att snabbt rekonstrueras eller optimeras genom att tillhandahålla biokemiska bevis för att stödja och expandera genomiska bevis. Detta arbete kommer att visa användningen av PM-analyser för studier av mikroalger genom att använda den gröna mikroalgala modellarten Chlamydomonas reinhardtii som exempel. Experimentella bevis för över 254 reaktioner erhållna av PM användes i denna studie för att expandera och förfina en genomskala C. reinhardtii metabolisk nätverksmodell, iRC1080, med cirka 25 procent. Protokollet som skapas här kan användas som grund för funktionell profilering av metabolismen av andra mikroalger, inklusive kända mikroalgermutanter och nya isolat.
Optimering av algmetabolism för förbättrad och stabil produktion av riktade metaboliter kräver utveckling av komplexa metaboliska tekniska strategier genom systemnivåanalyser av metaboliska nätverk. Metaboliska nätverksmodeller kan vägleda de rationella designerna för snabb utveckling av optimeringsstrategier1,2,3,4. Även om cirka 160 mikroalgala arter harsekvenserats 5, finns det enligt vår kunskap endast 44 algmetaboliska modeller tillgängliga4,6,7. På grund av svårigheten att erhålla metaboliska fenotypiska data med hög genomströmning för experimentell validering av genomisk information ligger återuppbyggnaden av högkvalitativa nätverksmodeller efter den snabba utvecklingen av alggenomsekvensering.
C. reinhardtii är ett attraktivt modellsystem för algbaserade studier. Denna art kan växa fotoautotrophically eller heterotrophically och har använts i stor utsträckning som en modellorganism i grundläggande och tillämpad forskning. Dess genomsekvens publicerades 20078, med genomskalade metaboliska modeller som senare rekonstruerades för arten9,10,11. Genomskalan för C. reinhardtii (iRC1080) rekonstruerades av Chang et al. 10 baserat på genomiska och litteraturbevis (med ~250 källor). Den har 1 706 metaboliter med 2 190 reaktioner10; Modellens fullständighet kunde dock inte kontrolleras utöver de tillgängliga offentliggjorda experimentella bevisen vid den tidpunkten.
Fenotypmikroarrays (PMs) teknik är en plattform med hög genomströmning som kan ge metabolisk profileringsinformation för heterotrofa mikroorganismer samt vävnadskulturceller. I synnerhet kan det användas för att ta itu med kunskapsgapet fenotyp till genotyp i mikroalger, som först rapporterades för Chlamydomonas reinhardtii12 och därefter för en art av kloroidium13 och Chlorella14. Genom att studera cellsvar på tusentals metaboliter, signalmolekyler, osmolyter och effektormolekyler kan PM-analyserna ge funktionell metabolisk profilering och ge insikter om funktion, metabolism och miljökänslighet15,16,17. Specifikt detekterar PM-analyser cellers metabolitanvändning i 96-brunns mikroplattor med olika näringsämnen, metaboliter eller osmolyter som finns i varje brunn. Dessutom är det också möjligt att analysera bioaktiva molekyler, såsom antibiotika och hormoner. Som bestäms av färgproduktionens intensitet genom NADH-reduktionen av ett tetrazoliumbaserat redoxfärgämne utvärderas det metaboliska utnyttjandet av substrat i termer av cellandning15,16,17. Experimenten i 96-brunnsmikroplattor kan övervakas och bestämmas automatiskt över tid med plattformen för fenotypmikroarrayinstrument (PMI). Tjugo 96-brunns mikroplattor är utformade för att representera de vanliga uppsättningen metaboliter för att studera cellulära fenotyper för att använda kol-, kväve-, svavel- och fosforkällor, tillsammans med olika osmotiska / jon- och pH-effekter. PM-tekniken har framgångsrikt använts för att uppdatera och uppgradera ett antal befintliga genomskalade metaboliska modeller för mikroorganismer15,16,17,18.
Protokollet och data som visas här är baserade på tidigare publicerade verk av Chaiboonchoe et al. 12 Det presenterade arbetet beskriver användningen av PM-analysmetoden för att karakterisera de metaboliska fenotyperna av mikroalger och för att utöka en befintlig algmetabolisk modell av C. reinhardtii samt för att vägleda återuppbyggnaden av nya metaboliska modeller.
Metabolisk fenotypning av den gröna microalga, C. reinhardtii, beskrevs här med hjälp av hög genomströmning PM analys plattor och en oförändrad PMI. Testerna användes för totalt 190 kolkällor (PM01 och PM02), 95 kvävekällor (PM03), 59 fosforkällor och 35 svavelkällor (PM04), tillsammans med peptidkvävekällor (PM06-08). Positiv andning observerades för 148 näringsämnen (en positiv analys för användning av C-källor, fyra positiva analyser för varje användning av S-källan och P-källan och 139 positiva analyser för användning av N-källor). Mediets substrat eller näringsämnen (kol, kväve, fosfor eller svavel) bör inte tillsättas det definierade mediet när de appliceras på de relevanta PM-mikroplattor som testar för var och en av dessa källor.
Metoden som visas här är effektiv för att karakterisera metaboliska mikroalgerfenotyper som kan användas för att utöka befintliga metaboliska nätverksmodeller eller styra återuppbyggnaden av nya modeller. Vidare, eftersom näringsbehoven hos de flesta mikroalger inte är kända, kan denna plattform användas för att definiera dessa snabbt. Nelson et al. 43 hade framgångsrikt tillämpat dessa metoder för att identifiera nya föreningar som stöder tillväxten av mikroalger Chloroidium sp. UTEX 3007 och använt den erhållna informationen för att definiera artinträdemetaboliter, som till skillnad från Chlamydomonas omfattar 40 olika kolkällor.
En viktig begränsning av pm för profilering av mikroalger är att PMI inte har någon belysning i inkubationskammaren, och mikroalger måste kunna utföra heterotrofisk metabolism. Frånvaron av ljus kan påverka tolkningen av modeller som innehåller ljus för att beräkna metaboliska flöden. Genpar med koordinerande funktioner har utvecklats tillsammans för att utgöra metaboliska nätverkshubbar, och skillnaden mellan fotosyntetiska och icke-fotosyntetiska nätverkshubbar kan göras44. I allmänhet skulle fotosyntetiska nätverkshubbar (dvs. höganslutna noder i modellen) utelämnas från heterotrofa modeller. För praktiska ändamål bör modellering av heterotrofiism hos mixotrofiska arter utelämna reaktioner som är kända för att drivas av ljus och ta hänsyn till energibalansskillnaderna mellan förhållandena. Således är modellering av ljusberoende och ljusoberoende metabolism standardpraxis i Chlamydomonas metabolisk modellering6,45.
Vissa gröna mikroalger, som Trebouxiophytes, är kända för att assimilera en mängd olika kolmolekyler för tillväxt, och detta tros ha uppstått från deras långa evolutionära historia som medlemmar i lavar46. Medan klorofyller som Chlamydomonas kan använda acetat för tillväxt, den bruna marina mikroalga Tisochrysis lutea, känd för sin potential att kommersiellt producera mycket långkedjiga fleromättade fettsyror (VLC-PUFAs), kan inte använda acetat men kan använda glycerol för tillväxt47. Biomassakoncentration på mer än 100 g l−1 torrcellsvikt har uppnåtts med Chlorella med optimerad tillsats av organiska kolkällor i fed-batch-läge48. Vidare kan tillsats av socker till Chlorellavulgaris höja dess bindning av CO2, vilket ger en additiv fördel under fotosyntetisk tillväxt49. De flesta heterotrofa mikroalger kan också växa mixotrohically, men klorofyllen Chromochloris zofingiensis har visat sig stänga av fotosyntes vid tillsats av socker50.
Diatomer, som tillhör divisionen Bacillariophyta, är en stor grupp fytoplankton. Även om de flesta diatomer bara kan växa fotoautotrophically, kan några av dem odlas mixotrophically eller heterotrophically51. Till exempel, glycerol konstaterades stödja tillväxt i ljuset i avsaknad av CO2 i vissa kiselalger, inklusive modellarten Phaeodactylum tricornutum52. Vissa benthic diatoms som Nitzschia linearis kan också växa på kolhydrater i mörkret53. Det är sannolikt att utvidga PM-analyserna till diatomer och andra alggrupper genom att komplettera lämpliga organiska kolkällor för att cellerna ska kunna växa heterotrofiiskt, och en mixotrofistrategi kan också potentiellt användas för den obligatoriska autotrofiska mikroalger som ger en minimalt nödvändig ljustillförsel.
För att bedöma uppgifternas reproducerbarhet rekommenderas det starkt att duplicerade analyser utförs för alla plattor. En analys kan endast anses vara positiv om absorbansen (PMI-värdet) är positiv efter subtraktion från den negativa kontrollen och respektive blanka brunnar. Denna beskrivning, i närvaro av den testade föreningen, är en återspegling av färgämnets abiotiska reaktion med mediet.
The authors have nothing to disclose.
Stort stöd för detta arbete tillhandahölls av NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), finansierat av Tamkeen under New York University Abu Dhabi Research Institute grant (73 71210 CGSB9) och NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. stöttades dessutom av hundratalangprogram av Zhejiang universitetar. Vi tackar Ashish Jaiswal för hjälpen med att spela in videon. Vi tackar Hong Cai för att generera metaboliska fenotypdata.
Ampicillin | VWR | 97062-796 | |
Biolog assay plates [ PM01-08] | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Biolog Omnilog Instrument | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 | Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. | Regents of the University of Minnesota | |
Kanamycin | VWR | 0408-EU-10G | |
Tetrazolium Violet Dye “D” | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Timentin | GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd | 42010012-2 |