マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化
Summary
本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。
Abstract
生理的電界(EF)は、細胞の移動、分化、分裂、死に重要な役割を果たしています。本論文では、顕微鏡を用いた長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムについて述べている。マイクロ流体システムは、光学的に透明な電気戦術チップ、透明なインジウムスズ酸化物(ITO)ヒーター、培養メディア充填ポンプ、電力供給、高周波パワーアンプ、EFマルチプレクサ、プログラマブルX-Y-Z電動ステージ、およびデジタルカメラを搭載した逆位相対向顕微鏡の主要コンポーネントで構成されています。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。この研究は、直流(DC)パルス刺激によって誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化を伴う。幹細胞維持培地では、マウスNPC(mNPC)は、DCパルス刺激後にニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化した。この結果は、単純なDCパルス治療がmNPCの運命を制御し、神経系障害の治療戦略を開発するために使用できることを示唆している。このシステムは、複数のチャネルでの細胞培養、長期EF刺激、細胞形態観察、および自動タイムラプス画像取得に使用できます。このマイクロ流体システムは、必要な実験時間を短縮するだけでなく、微小環境の制御精度を向上させます。
Introduction
神経前駆細胞(NPC、神経幹および前駆細胞とも呼ばれる)は、神経変性治療戦略1の有望な候補となり得る。未分化NPCは自己再生能力、多効力、増殖能力2,3を有する。以前の研究では、細胞外マトリックスと分子メディエーターがNPCの分化を調節することが報告されています。表皮成長因子(EGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はNPC増殖を促進し、従って未分化状態を維持する4。
これまでの研究では、電気刺激は、除算5、移動6、7、8、分化1、9、10、および細胞死11のような細胞生理学的活動を調節することができるという報告がある。電気分野(EF)は、中枢神経系の発達12,13,14の発達と再生において重要な役割を果たす。2009年から2019年にかけて、この研究室は、マイクロ流体システム1、6、7、8、15、16、17におけるEFの適用に対する細胞応答を調査した。マルチチャネル、光学的に透明な電気戦術(MOE)チップは、共焦点顕微鏡用の免疫蛍光染色に適するように設計された。このチップは、高い光学透過性と耐久性を有し、1回の研究で3つの独立した刺激実験といくつかの免疫染色条件の同時実施を可能にした。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。本論文では、長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムの開発について述べた。
Protocol
1. MOEチップの設計と製作 適切なソフトウェアを使用して、個々のポリメチルメタクリレート(PMMA)層と両面テープのパターンを描画します(図1A、材料表)。PMMAシートと両面テープの両方をCO2レーザーマシンスクライバで切ります(図1B)。 CO2レーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。ソフト?…
Representative Results
MOE チップの詳細な構成を図 1に示します。マイクロ流体チップは、実験用セットアップサイズ、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。MOEチップは、単独の研究で3つの独立したEF刺激実験と複数の免疫染色条件を同時に行うよう設計された(図3)。また、高い光学透過性を有するMOEチップは、?…
Discussion
MOEチップの製造中、アダプターは高速作用性シアノアクリレート接着剤でMOEチップのレイヤ1に取り付けられます。接着剤は、アダプターの4つのコーナーに適用され、その後、圧力は、アダプターの上に均等に適用されます。接着剤の完全な重合を確実にするために接着剤の過剰な量を避ける必要があります。さらに、完成したMOEチップアセンブリは真空チャンバ内でインキュベートされま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、シンニカ医教アカデミー生物医学研究所の唐K.唐教授に対し、マウス神経幹細胞および前駆細胞(mNPC)の提供に協力してくれたことに感謝している。著者らはまた、mNCCの差別化に関する貴重な議論をした唐K.唐教授とインシャン・リー氏に感謝する。
Materials
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
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Cite This Article
Chang, H., Chou, S., Cheng, J. Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (170), e61917, doi:10.3791/61917 (2021).