Diferenciación celular precursora neuronal inducida por campo eléctrico en dispositivos microfluídicos
Summary
En este estudio, presentamos un protocolo para la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas únicamente por estimulación del pulso de corriente directa (DC) en un sistema microfluídico.
Abstract
Los campos eléctricos fisiológicos (EF) desempeñan un papel vital en la migración celular, la diferenciación, la división y la muerte. Este artículo describe un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo utilizando microscopía. El sistema microfluídico consta de los siguientes componentes principales: un chip electrotáctico ópticamente transparente, un calentador transparente de óxido de indio-estaño (ITO), una bomba de llenado de medios de cultivo, una fuente de alimentación eléctrica, un amplificador de potencia de alta frecuencia, un multiplexor EF, una etapa motorizada X-Y-Z programable y un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara digital. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este trabajo implica la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas por estimulación del pulso de corriente directa (CC). En el medio de mantenimiento de células madre, los PNJ del ratón (MNPC) se diferenciaron en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos después de la estimulación del pulso de CC. Los resultados sugieren que el tratamiento simple del pulso de CC podría controlar el destino de los MNPC y podría utilizarse para desarrollar estrategias terapéuticas para los trastornos del sistema nervioso. El sistema se puede utilizar para el cultivo celular en múltiples canales, para la estimulación ef a largo plazo, para la observación morfológica celular y para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo. Este sistema microfluídico no sólo acorta el tiempo experimental requerido, sino que también aumenta la precisión del control en el microambiente.
Introduction
Las células precursoras neuronales (NPCs, también conocidas como células madre neurales y progenitoras) pueden ser como un candidato prometedor para la estrategia terapéutica neurodegenerativa1. Los PNJ indiferenciados tienen capacidad de autorretración, multipotencia y capacidad proliferativa2,3. Un estudio anterior ha informado de que la matriz extracelular y los mediadores moleculares regulan la diferenciación de NPC. El factor de crecimiento epidérmico (FEAG) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) promueven la proliferación de NPC, manteniendo así el estado indiferenciado4.
Estudios previos han informado que la estimulación eléctrica puede regular las actividades fisiológicas celulares como la división5,la migración6,7,8,la diferenciación1,9,10,y la muerte celular11. Los campos eléctricos (EF) desempeñan un papel vital en el desarrollo y regeneración del desarrollo del sistema nervioso central12,13,14. De 2009 a 2019, este laboratorio ha investigado las respuestas celulares a la aplicación de EF en el sistema microfluídico1,6,7,8,15,16,17. Un chip multicanal, ópticamente transparente y electrotáctico (MOE) fue diseñado para ser adecuado para la tinción de inmunofluorescencia para microscopía confocal. El chip tenía alta transparencia óptica y buena durabilidad y permitió la realización simultánea de tres experimentos de estimulación independientes y varias condiciones inmunodeprimadas en un solo estudio. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este artículo describe el desarrollo de un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la fabricación del chip MOE, los adaptadores se unen a la Capa 1 del chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida. El pegamento se aplica a 4 esquinas de los adaptadores, y luego la presión se aplica uniformemente sobre los adaptadores. Se debe evitar el exceso de pegamento para garantizar la polimerización completa del pegamento. Además, el conjunto de chips MOE completado se incuba en una cámara de vacío. Este paso ayuda a eliminar las burbujas entre la capa PMMA, la cinta de doble cara y el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al profesor Tang K. Tang, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Academia Sinica, su ayuda para proporcionar células progenitoras y madre neural del ratón (MNPCs). Los autores también agradecen al Profesor Tang K. Tang y a la Sra. Ying-Shan Lee, su valioso debate sobre la diferenciación de los MNPC.
Materials
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
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