I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for differentiering af neurale stamceller og stamceller (NPC’ere), der udelukkende er fremkaldt af jævnstrøms (DC) pulsstimulation i et mikrofluidisk system.
Fysiologiske elektriske felter (EF) spiller afgørende roller i cellemigration, differentiering, division og død. Dette papir beskriver et mikrofluidisk cellekultursystem, der blev brugt til en langsigtet celledifferentieringsundersøgelse ved hjælp af mikroskopi. Det mikrofluidiske system består af følgende hovedkomponenter: en optisk gennemsigtig elektrotaktisk chip, en gennemsigtig indium-tin-oxid (ITO) varmelegeme, en kultur mediefyldningspumpe, en elektrisk strømforsyning, en højfrekvent effektforstærker, en EF-multiplexer, en programmerbar X-Y-Z motoriseret fase og et omvendt fasekontrastmikroskop udstyret med et digitalt kamera. Det mikrofluidiske system er gavnligt med hensyn til at forenkle den overordnede eksperimentelle opsætning og til gengæld reagens- og prøveforbruget. Dette arbejde indebærer differentiering af neurale stamceller og stamceller (NPC’er) induceret af jævnstrøm (DC) pulsstimulation. I stamcellevedligeholdelsesmediet differentierede musens NPC’er (mNPC’er) sig til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter efter DC-pulsstimulationen. Resultaterne tyder på, at simpel DC puls behandling kunne kontrollere skæbnen for MNPC’er og kan bruges til at udvikle terapeutiske strategier for nervesystemet lidelser. Systemet kan bruges til cellekultur i flere kanaler, til langsigtet EF-stimulering, til cellemorfologiske observationer og til automatisk time-lapse billedopsamling. Dette mikrofluidiske system forkorter ikke kun den krævede forsøgstid, men øger også nøjagtigheden af kontrollen med mikromiljøet.
Neurale prækursorceller (NPC’ere, også kendt som neurale stamceller og stamceller) kan være som en lovende kandidat til neurodegenerativ terapeutisk strategi1. De udifferentierede NPC’ere har selvfornyelseskapacitet , multistyrke og proliferativ evne2,3. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at den ekstracellulære matrix og molekylære mæglere regulere differentiering af NPC. Den epidermale vækstfaktor (EGF) og den grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF) fremmer NPC-spredning og opretholder dermed den udifferentierede tilstand4.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at elektrisk stimulation kan regulere cellefysiologiske aktiviteter som division5, migration6,7,8, differentiering1,9,10og celledød11. Elektriske felter (EFs) spiller afgørende roller i udviklingen og regenerering af centralnervesystemet udvikling12,13,14. Fra 2009 til 2019 har dette laboratorium undersøgt cellulære reaktioner på anvendelsen af EF i det mikrofluidiske system1,6, 7,8,15,16,17. En multikanal, optisk gennemsigtig, elektrotaktisk (MOE) chip er designet til at være egnet til immunfluorescens farvning til konfokal mikroskopi. Chippen havde høj optisk gennemsigtighed og god holdbarhed og tillod samtidig udførelse af tre uafhængige stimulationseksperimenter og flere immunostained betingelser i en enkelt undersøgelse. Det mikrofluidiske system er gavnligt med hensyn til at forenkle den overordnede eksperimentelle opsætning og til gengæld reagens- og prøveforbruget. Dette papir beskriver udviklingen af et mikrofluidisk cellekultursystem, der blev brugt til en langsigtet celledifferentieringsundersøgelse.
Under fremstillingen af MOE-chippen fastgøres adapterne til MOE-chippens lag 1 med hurtigtvirkende cyanoacrylatlim. Limen påføres 4 hjørner af adapterne, og derefter påføres trykket jævnt over adapterne. Overskydende mængde lim skal undgås for at sikre fuldstændig polymerisering af limen. Desuden inkuberes den færdige MOE-chipsamling i et vakuumkammer. Dette trin hjælper med at fjerne boblerne mellem PMMA-laget, det dobbeltsidede bånd og dækglasset.
Valget af elektrodematerialet …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker professor Tang K. Tang, Institut for Biomedicinske Videnskaber, Academia Sinica, for hans hjælp til at give mus neurale stamceller og stamceller (mNPC’er). Forfatterne takker også professor Tang K. Tang og Ms Ying-Shan Lee, for deres værdifulde diskussion om differentiering af MNPC’er.
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |