I denna studie presenterar vi ett protokoll för differentiering av neurala stam- och stamceller (NPCs) som enbart induceras av likströmspulsstimulering (DC) i ett mikrofluidiskt system.
Fysiologiska elektriska fält (EF) spelar viktiga roller i cellmigration, differentiering, uppdelning och död. Detta dokument beskriver ett mikrofluidiskt cellkultursystem som användes för en långsiktig cell differentiering studie med hjälp av mikroskopi. Det mikrofluidiska systemet består av följande huvudkomponenter: ett optiskt transparent elektrotaktiskt chip, en transparent INDIUM-tennoxidvärmare (ITO), en odlingsmediefyllningspump, en elektrisk strömförsörjning, en högfrekvent effektförstärkare, en EF-multiplexer, ett programmerbart X-Y-Z-motoriserat steg och ett inverterat faskontrastmikroskop utrustat med en digitalkamera. Det mikrofluidiska systemet är fördelaktigt för att förenkla den övergripande experimentella installationen och i sin tur reagens- och provförbrukningen. Detta arbete innebär differentiering av neurala stam- och stamceller (NPC) inducerad av likströmspulsstimulering ( DC). I stamcellsunderhållsmediet differentierade musen NPC (mNPC) i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter efter DC-pulsstimuleringen. Resultaten tyder på att enkel DC puls behandling kan kontrollera ödet för mNPCs och kan användas för att utveckla terapeutiska strategier för nervsystemet störningar. Systemet kan användas för cellkultur i flera kanaler, för långsiktig EF-stimulering, för cellmorfologisk observation och för automatisk tidsfördröjning av bildförvärv. Detta mikrofluidiska system förkortar inte bara den experimentella tid som krävs, utan ökar också noggrannheten i kontrollen av mikromiljön.
Neurala prekursorceller (NPC, även känd som neurala stam- och stamceller) kan vara som en lovande kandidat för neurodegenerativ terapeutisk strategi1. De odifferentierade npc:erna har självförnyelsekapacitet, multipotens och proliferativförmåga 2,3. En tidigare studie har rapporterat att den extracellulära matrisen och molekylära medlare reglerar differentiering av NPC. Epidermal tillväxtfaktor (EGF) och grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) främja NPC spridning, därmed upprätthålla det odifferentierade tillståndet4.
Tidigare studier har rapporterat att elektrisk stimulering kan reglera cellfysiologiska aktiviteter som division5,migration6,7,8, differentiering1,9,10och celldöd11. Elektriska fält (EFs) spelar viktiga roller i utvecklingen och förnyelsen av centrala nervsystemet utveckling12,13,14. Från 2009 till 2019 har detta laboratorium undersökt cellulära svar på tillämpningen av EF i det mikrofluidiska systemet1,6,7,8,15,16,17. Ett flerkanaligt, optiskt transparent, elektrotaktiskt (MOE) chip utformades för att vara lämpligt för immunofluorescensfärgning för konfokal mikroskopi. Chippet hade hög optisk transparens och god hållbarhet och tillät samtidig genomförande av tre oberoende stimuleringsexperiment och flera immunstained villkor i en enda studie. Det mikrofluidiska systemet är fördelaktigt för att förenkla den övergripande experimentella installationen och i sin tur reagens- och provförbrukningen. Detta dokument beskriver utvecklingen av ett mikrofluidiskt cellkultursystem som användes för en långsiktig cell differentieringsstudie.
Under tillverkningen av MOE-chipet fästs adaptrarna på MOE-chipets skikt 1 med snabbverkande cyanoakrylatlim. Limet appliceras på adaptrars 4 hörn och sedan appliceras trycket jämnt över adaptrar. Överskott av lim måste undvikas för att säkerställa fullständig polymerisering av limet. Dessutom inkuberas den färdiga MOE-spånenheten i en vakuumkammare. Det här steget hjälper till att ta bort bubblorna mellan PMMA-skiktet, den dubbelsidiga tejpen och täckglaset.
Valet av elektrod…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar professor Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, för hans hjälp med att tillhandahålla musneurala stam- och stamceller (mNPCs). Författarna tackar också professor Tang K. Tang och Ms. Ying-Shan Lee, för deras värdefulla diskussion om differentiering av mNPCs.
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |