Песчаная муха (Phlebotomus papatasi) Микроинъекция эмбрионов для CRISPR/Cas9 Mutagenesis
Summary
В этом протоколе подробно известен этап целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 у песчаных мух: сбор эмбрионов, инъекция, выращивание насекомых и идентификация, а также выбор мутаций, представляющих интерес.
Abstract
Песчаные мухи являются естественными переносчиками для видов лейшмании, простейших паразитов, производящих широкий спектр симптомов, начиная от кизанных поражений и до висцеральной патологии. Расшифровка характера взаимодействия вектора/паразита имеет первостепенное значение для лучшего понимания передачи Лейшмании их хозяевам. Среди параметров, контролирующих компетентность переносчика песчаной мухи (т.е. их способность нести и передавать патогенные микроорганизмы), параметры, присущие этим насекомым, были показаны, чтобы играть ключевую роль. Иммунный ответ насекомых, например, влияет на песок летать вектор компетенции Лейшмании. Изучение таких параметров было ограничено отсутствием методов модификации экспрессии генов, адаптированных для использования в этих не модельных организмах. Ген вниз регулирования путем небольшого вмешательства РНК (siRNA) возможно, но в дополнение к технически сложной задачей, замалчивание приводит лишь к частичной потере функции, которые не могут передаваться из поколения в поколение. Целевой мутагенез по технологии CRISPR/Cas9 был недавно адаптирован к песчаной мухе Phlebotomus papatasi. Этот метод приводит к генерации трансмиссивных мутаций в специально выбранном локусе, что позволяет изучать гены, представляющие интерес. Система CRISPR/Cas9 опирается на индукцию целевых двухтяговых разрывов ДНК, которые впоследствии восстанавливаются либо не гомологичным присоединением к концу (NHEJ), либо Homology Driven Repair (HDR). NHEJ состоит из простого закрытия перерыва и часто приводит к небольшим событиям вставки/удаления. В отличие от этого, HDR использует наличие молекулы донорской ДНК обмена гомологии с целевой ДНК в качестве шаблона для ремонта. Здесь мы представляем метод микроинъекции эмбриона песчаной мухи для целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием NHEJ, который является единственным методом модификации генома, адаптированным к векторам песчаной мухи на сегодняшний день.
Introduction
Трансмиссивные болезни представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению в постоянной эволюции. По данным Всемирной организации здравоохранения, сотни видов переносчиков, распространяемых в очень различных филогенных семьях (например, комары, клещи, блохи), являются причиной передачи огромного количества микробных патогенов, что приводит к более чем 700 000 случаев смерти человека в год. Среди переносчиковых насекомых, флеботомин песчаных мух (Diptera, Psychodidae) составляют обширную группу, с 80 проверенных видов переносчиков, проявляли различные фенотипические черты и векторные возможности, найденные в различных географических регионах. Они являются переносчиками простейших паразитов рода Leishmania,вызывая около 1,3 миллиона новых случаев лейшманиозов и от 20 000 до 30 000 смертей в год. Клинические исходы лейшмании разнообразны, с симптомами, начиная от самоограничения кожных поражений висцерального распространения, которое является фатальным в отсутствие лечения.
Песчаные мухи – это строго наземные насекомые. Их жизненный цикл, относительно длинный по сравнению с другими Diptera, длится до трех месяцев, в зависимости от различных параметров, таких как температура, влажность и питание. Она состоит из одной эмбриональной стадии (от 6 до 11 дней), четырех личиновидных стадий (продолжительностью от 23 до 25 дней) и одной стадии детеныша (от 9 до 10 дней), за которой следуют метаморфозы, а затем взрослая жизнь. Песчаные мухи требуют влажной и теплой среды для выращивания. Как самцы, так и самки питаются сахаром, полученным в дикой природе из цветочных нектаров. Только самки кровоохими, так как они требуют белков, полученных из крови еды для производства яиц1.
Важным направлением исследований является выявление характера взаимодействия переносчика/паразита, которые приводят к развитию трансмиссивных инфекций. Как и в случае с другими переносчиками насекомых, параметры, присущие песчаным мухам, как было показано, влияют на их векторную компетентность, которая определяется как их способность нести и передавать патогенные микроорганизмы своим хозяевам. Например, экспрессия галектинов phlebotomus papatasi песка летать midgut клетки, выступающие в качестве рецепторов, распознающих компоненты поверхности паразита, может непосредственно влиять на их вектор компетентности для Лейшмании основных2,3. Путь иммунного ответа насекомых, Иммунодефицит (IMD), также имеет решающее значение для Phlebotomus papatasi песка летать вектор компетенции лейшмании основных4. Критическая роль для векторных путей иммунного ответа насекомых в контроле их передачи инфекционных патогенов была также зарегистрирована в комарах Aedes aegypti 5,6,7, в цеце летают Glossina morsitans8, и у комаров Anopheles gambiae 9,10.
Исследования взаимодействия песчаноймухи/Лейшмании были ограничены отсутствием методов модификации экспрессии генов, адаптированных для использования у этих насекомых. Только ген downregulation малым вмешиваясь RNA (siRNA) был выполнен11,12,13,14 до недавнего времени. Техника, ограниченная смертностью, связанной с микроинъекцией взрослых самок, приводит лишь к частичной потере функции, которая не может передаваться из поколения в поколение.
Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в функциональных геномных исследованиях в не моделных организмах, таких как песчаные мухи. Измененная из адаптивной иммунной системы в прокариотах для защиты отбактериофагов 15,16, система CRISPR Cas9 была быстро адаптирована в качестве инструмента редактирования генома для превосходных эукариотических организмов, включая насекомых. Принцип целевого редактирования генома CRISPR/Cas9 основан на взаимодополняемости одного направляющей РНК (sgRNA) к определенному геномного локуса. Ядро Cas9 связывается с sgRNA и создает двухструновую ДНК (dsDNA) разрыв в геномной ДНК, где sgRNA ассоциируется с его дополнительной последовательности. Комплекс Cas9-sgRNA направляется к целевой последовательности от 17 до 20 дополнительных баз в sgRNA к выбранному локусу, разрыв dsDNA может быть отремонтирован двумя независимыми путями: nonhomologous присоединением конца (NHEJ) или гомологией направленного ремонта (HDR)17. Ремонт NHEJ включает в себя простое закрытие перерыва, но часто приводит к небольшим событиям вставки/удаления. ДНК ремонт через HDR использует молекулы донорской ДНК обмена гомологии с целевой ДНК в качестве шаблона для ремонта. Насекомые обладают обоими станками.
Технология CRISPR/Cas9 может генерировать мутации в выбранном локусе через путь ремонта NHEJ; или для более сложных стратегий редактирования генома, таких как стук-ины или выражения репортеров, через путь HDR с соответствующим донорским шаблоном. В песчаных мух, нулевой мутант аллели фактора иммунного ответа Relish были созданы через NHEJ-опосредованного CRISPR в Phlebotomus papatasi4. Эмбрионы песчаной мухи были также введены в другом исследовании с смесью CRISPR/Cas9, ориентированной на ген, кодирующий желтый. Тем не менее, ни один взрослый проведения мутации былипроизведены 18. Мы описываем здесь подробный метод песка летать целевых мутагенез NHEJ-опосредованного CRISPR/Cas9, с особым акцентом на микроинъекции эмбриона, критический шаг протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем здесь недавно разработанный метод микроинъекции эмбриона для целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 у песчаных мух Phlebotomus papatasi. Микроинъекция эмбрионов для генетической модификации насекомых была разработана в Дрозофиле в середине 1980-хгодов 21 и в настоящее врем?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Ванессу Мелденер-Харрелл за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant’Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant’anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant’Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
