Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli
Summary
Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.
Abstract
Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA’ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA’ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.
Introduction
Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar1dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR’lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Birçok araştırma çalışması protein kodlayan RNA’ların adiposit fizyolojislerindeki rolünü ve obezite ile ilişkisini araştırmıştır.
Daha yakın zamanlarda, kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar), özellikle mikro RNA’ların (MIR’ler) keşfi, gen ekspresyon programlarının düzenleme mekanizmasıyla ilgili yeni kavramlar ortaya çıkarmıştır. Çalışmalar, ncRNA’ların adiposit fonksiyonunun önemli düzenleyicileri olduğunu ve düzensizliklerinin metabolik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını göstermiştir4. Bu nedenle, adipositlerdeki proteinlerin ve ncRNA’ların manipülasyonu, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve T2D gibi patolojiler üzerindeki etkilerini çözmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, in vivo proteinlerin ve ncRNA’ların yanı sıra birincil adipozitlerde ekspresyonunun manipüle edilmesi, in vitro adiposit modellerinin kullanımını destekleyen son derece zorlu olmaya devam etmektedir.
Murine 3T3-L1 fibroblastları, adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılan iyi karakterize edilmiş bir hücre hattı olan olgun, fonksiyonel ve insülin duyarlı adipositlere kolayca farklılaşır (örneğin, insülin sinyali, glikoz alımı, lipoliz ve adipokines salgısı)5,6,7,8,9,10. Bu özellikler, 3T3-L1 adipositlerini, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerini çözmek için protein kodlama ve nc-RNA’ların ekspresyonunu modüle etmek için çekici bir model haline getirir. Ne yazık ki, 3T3-L1 fibroblastların ticari olarak mevcut reaktifler kullanılarak transfect’i kolayken, farklılaştırılmış 3T3-L1 adipositler transfect için en zor hücre çizgilerinden biridir. Bu nedenle 3T3-L1 hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle eden çok sayıda çalışma, adiposit fonksiyonu yerine adiposit farklılaşmasına odaklanmıştır.
Uzun bir süre boyunca, adipositleri transfect etmek için tek etkili teknik elektroporasyon5, sıkıcı, pahalı ve hücre hasarına neden olabilir. Bu makale, transfeksiyon için uygulamalı zamanı azaltan, hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan ve elektroporasyondan çok daha ucuz olan ortak bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ters transfeksiyon tekniğini rapor eder. Bu protokol, siRNA ve mikro-RNA mimikleri (miR mimikleri) ve anti-miR’ler gibi diğer oligonükleotidlerin transfeksiyonu için mükemmel bir şekilde uygundur. Ters transfeksiyon protokolünün prensibi, transfeksiyon reaktifini ve oligonükleotidleri kuluçkaya yatırarak hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak ve daha sonra olgun adipositleri kuyulara tohumlamaktır. Daha sonra, adipositler oligonükleotidler / transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden yapışır. Bu basit, verimli ve ucuz metodoloji, protein kodlayan RNA’ların ve MIR’lerin adiposit fonksiyonundaki rolünün ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerinin incelenmesine izin vermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA’lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA’lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma INSERM, Université Côte d’Azur ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından gelecekteki Mükemmellik Laboratuvarı yatırımları (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ve Mükemmellik Girişimi (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) programı aracılığıyla desteklenmiştir. J.J., Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) ve Fondation Benjamin-Delessert’in bağışlarıyla desteklenmektedir. J.G. ANR-18-CE14-0035-01 tarafından desteklenir. J-F.T., ANR hibesi ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ve Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes tarafından finanse edilen C3M Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve CBS IBiSA Mikroskopi ve Görüntüleme Platformu Côte d’Azur (MICA) tarafından da desteklenen Région PACA’ya teşekkür ediyoruz.
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
