Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Oligonukleotide wie small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs) oder anti-micro-RNA (anti-miR) in reife Adipozyten zu liefern, um die Protein- und micro-RNA-Expression zu modulieren.
Abstract
Die Veränderung der Adipozytenfunktion trägt zur Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und Insulinresistenz bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Die Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in Adipozyten bleibt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Differenzierung muriner Fibroblasten in reife Adipozyten und zur Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in reifen Adipozyten durch Reverse-Transfektion unter Verwendung von small-interfering RNA (siRNA) und micro-RNA mimicking (miR mimic) Oligonukleotiden. Dieses Reverse-Transfektionsprotokoll beinhaltet die Inkubation des Transfektionsreagenz und der Oligonukleotide, um einen Komplex in der Zellkulturplatte zu bilden, zu dem die reifen Adipozyten hinzugefügt werden. Die Adipozyten dürfen sich dann in Gegenwart des Oligonukleotid-/Transfektionsreagenzienkomplexes wieder an der adhärenten Plattenoberfläche befestigen. Funktionelle Analysen wie die Untersuchung der Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse können an den transfizierten 3T3-L1 reifen Adipozyten durchgeführt werden, um den Einfluss von Protein- oder Mikro-RNA-Manipulation auf die Adipozytenfunktion zu untersuchen.
Introduction
Fettleibigkeit gilt als Hauptrisikofaktor für zahlreiche Stoffwechselerkrankungen, darunter Insulinresistenz (IR), Typ-2-Diabetes (T2D) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. Aktuelle Therapien haben es nicht geschafft, die ständig steigende Prävalenz dieser Krankheiten zu stoppen, und das Management der IR von adipösen und diabetischen Patienten bleibt ein wichtiges klinisches Problem. Fettgewebe spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Energieöostase, und seine pathologische Ausdehnung während der Fettleibigkeit trägt zur Entwicklung von IR und T2D2,3bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Viele Forschungsstudien haben die Rolle proteinkodierender RNAs in der Adipozytenphysiologie und ihre Assoziation mit Fettleibigkeit untersucht.
In jüngerer Zeit hat die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), insbesondere Mikro-RNAs (miRs), neue Konzepte im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Regulation von Genexpressionsprogrammen entwickelt. Studien haben gezeigt, dass ncRNAs wichtige Regulatoren der Adipozytenfunktion sind und dass ihre Dysregulation eine wichtige Rolle bei Stoffwechselerkrankungen spielt4. Daher ist die Manipulation von Proteinen und ncRNAs in Adipozyten entscheidend, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre Auswirkungen auf Pathologien wie T2D zu entschlüsseln. Die Manipulation der Expression von Proteinen und ncRNAs in vivo sowie in primären Adipozyten bleibt jedoch eine große Herausforderung, was die Verwendung von In-vitro-Adipozytenmodellen begünstigt.
Murine 3T3-L1 Fibroblasten unterscheiden sich leicht in reife, funktionelle und insulin-responsive Adipozyten, die eine gut charakterisierte Zelllinie sind, die zur Untersuchung der Adipozytenfunktion verwendet wird (z. B. Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipolyse und Adipokinsekretion)5,6,7,8,9,10. Diese Eigenschaften machen 3T3-L1-Adipozyten zu einem attraktiven Modell, um die Expression von proteinkodierenden und nc-RNAs zu modulieren, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre potenzielle Rolle bei Adipositas-bedingten Krankheiten zu entschlüsseln. Während 3T3-L1-Fibroblasten mit handelsüblichen Reagenzien leicht zu transfizieren sind, sind differenzierte 3T3-L1-Adipozyten leider eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien. Aus diesem Grund haben sich zahlreiche Studien zur Manipulation der Genexpression in 3T3-L1-Zellen auf die Adipozytendifferenzierung und nicht auf die Adipozytenfunktion konzentriert.
Lange Zeit war die einzige effiziente Technik, um Adipozyten zu transfizieren, die Elektroporation5, die mühsam und teuer ist und Zellschäden verursachen kann. Dieser Artikel berichtet über eine Reverse-Transfektionstechnik mit einem gängigen Transfektionsreagenz, das die praktische Zeit für die Transfektion verkürzt, keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit hat und viel kostengünstiger ist als die Elektroporation. Dieses Protokoll eignet sich perfekt für die Transfektion von siRNA und anderen Oligonukleotiden wie Micro-RNA-Mimics (miR-Mimics) und Anti-MiRs. Das Prinzip des Reverse-Transfektionsprotokolls besteht darin, das Transfektionsreagenz und die Oligonukleotide zu einem Komplex in der Zellkulturplatte zu inkubieren und dann die reifen Adipozyten in die Vertiefungen zu säen. Dann befestigen sich die Adipozyten wieder an der adhärenten Plattenoberfläche in Gegenwart des Oligonukleotid/Transfektionsreagenzkomplexes. Diese einfache, effiziente und kostengünstige Methodik ermöglicht die Untersuchung der Rolle proteinkodierender RNAs und miRs bei der Adipozytenfunktion und ihrer potenziellen Rolle bei Adipositas-bedingten Erkrankungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung und Transfektion reifer Adipozyten vor. Diese Reverse-Transfektionsmethode ist eine einfache, wirtschaftliche und hocheffiziente Methode, um Oligonukleotide wie siRNAs, micro-RNA-Nachahmungen und Anti-Mikro-RNAs in 3T3-L1-Adipozyten zu transfizieren, was eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien ist. Diese Methode hat einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Dieses Protokoll ist nicht effizient für die Transfekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom INSERM, der Université Côte d’Azur und der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) durch das Programm Investitionen für das zukünftige Exzellenzlabor (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) und die Exzellenzinitiative (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) unterstützt. J.J. wird durch Zuschüsse der Société Francophone du Diabète (SFD), der Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), des Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) und der Fondation Benjamin-Delessert unterstützt. J.G. wird von ANR-18-CE14-0035-01 unterstützt. J-F.T. wird durch den ANR-Zuschuss ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 und einen Zuschuss der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) unterstützt. Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und auch von der GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA) unterstützt wird.
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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