코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징
Summary
본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.
Abstract
세포 재생 및 치료에 대한 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 효과를 연구하기 위해이 방법은 달팽이관 상피와 공동 배양 후 MSC 마이그레이션 및 형태 학적 변화를 추적합니다. 코르티의 장기는 해부 중에 생성된 Reissner 막의 일부를 눌러 플라스틱 커버슬립에 고정되었습니다. 실린더를 제거할 때 유리 실린더에 의해 수감된 MSC가 달팽이관 상피로 이동했습니다. 그들의 지배적인 국소화는 코르티의 기관의 modiolus에서 관찰되었다, 신경 섬유의 것과 유사한 방향으로 정렬. 그러나 일부 MsMC는 림푸스 지역에 국한되어 수평으로 길쭉한 모양을 보였습니다. 또한, 모발 세포 영역으로의 이동이 증가되었고, MSC의 형태는 가나마이신 치료 후 다양한 형태로 변경되었다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 달팽이관 상피와 MSC의 공존이 세포 이식을 통해 치료의 발달과 다양한 조건과 요인을 검사 할 수있는 세포 재생연구에 유용 할 것임을 나타냅니다.
Introduction
청력 손실은 선천적으로 발생할 수 있으며 노화, 약물 및 소음을 포함한 여러 가지 요인에 의해 점진적으로 발생할 수 있습니다. 청력을 담당하는 모발 세포가 손상되면 손상된 기능을 복원하기가 매우 어렵기 때문에 청력 손실은 종종 치료하기가어렵습니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 4억 6,100만 명이 청력 손실을 입은 것으로 추정되며, 이는 전 세계 인구의 6.1%를 차지합니다. 청력 상실을 가진 사람들 중 93%는 성인이고 7%는 어린이입니다.
청력 손실을 치료하기 위해 여러 가지 접근 법이 시도되었습니다. 특히, MSC를 이용한 재생 접근법은 유망한 치료법으로 부상했습니다. 조직이 손상되면, MSC는 자연적으로 순환 계통으로 방출되고 다양한 분자를 분비하는 상해 부위로 이동하여 재생을 촉진하는 미세 환경을 형성한다2. 따라서, 손상된 세포 기능3, 4, 5의 복원을 향상시키기 위해 강력한 면역 조절, 혈관신생 및 항 세포멸을 유발하는 분자의 장기 및 후속 분비를 표적으로 하는 외부 이식된 MSC의 이동을 통해 손상된 조직을 치료하는 방법을 개발하는 것이 중요하다3,4,5.
MSC가 손상된 조직으로 마이그레이션하는 호밍 프로세스가 극복해야 할 가장 중요한 장애물이 될 수 있습니다. MSC는 테더링 /롤링, 활성화, 체포, 트랜스 마이그레이션 / diapedesis 및 마이그레이션6,7,8의순차적 단계를 갖는 전신 호밍메커니즘을가지고 있습니다. 현재 이러한 단계를 개선할 방법을 파악하기 위한 노력이 진행 중입니다. 유전자 변형, 세포 표면 공학, 체외 프라이밍 및 자기 지도를 포함한 다양한 전략이6,7로테스트되었습니다. 또한 손상된 달팽이관 부위에 MSC를 호밍하여 청각 모발 세포의 보호 및 재생을 촉진하기 위한 여러 시도가 있었습니다. 그러나 생체 내에서 MSC를 추적하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 고도로 전문화된 기술9이필요합니다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 몇 시간 동안 세포의 이주를 촬영한 시간 경과 공초점 현미경검사를 통해 달팽이관내의 MSC의 호밍을 관찰하는 방법이 개발되었다(도1). 그것은 20세기 초에 개발 되었으며 최근 특정 세포의 마이그레이션을 공부 하기 위한 강력한 도구가 되고있다.
도 1: 그래픽 추상화. (A)코르티의 해부 기관이 집게를 사용하여 플라스틱 커버슬립에 부착된 후, 커버슬립은 35mm 유리 바닥의 공초점 미세한 접시에 배치되고(B)유리 실린더가 배치된다. (C)유리 실린더 내부를 중간으로 채운 후,(D)GFP 라벨이 부착된 MSC를 매체로 기르기 바깥에 신중하게 첨가한다. (E)하룻밤 동안 인큐베이션 후유리실린더가 제거되고, 이미지는 공초점 현미경으로 촬영된다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; MSC = 중간 엽 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
손상된 세포의 재생을 촉진하기 위해 손상된 부위로 MSC를 이식하는 것은 광범위하게 연구되었으며 치료 효과가 분명합니다. MSC의 이식 및 후속 분화는 3-니트로프로피온산(13)에 의해 유도된난청을 가진 쥐의 청력을 회복하는 것으로 보고되었다. Lee et al.은 인간에게 MSC를 적용했지만,14번 청각에서 상당한 개선을 이루지 못했습니다. 최근까지, MSC 이식에 의한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 한국국립연구재단(NRF)과 한림대학교 연구기금(NRF)의 연구보조금(NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66)에 의해 지원되었다.
Materials
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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