Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità
Summary
Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.
Abstract
Gli eterocicli spirociclici sono stati recentemente riportati in letteratura come potenziali farmaci per la terapia del cancro. La sintesi di questi nuovi sistemi ad anello ortogonale è impegnativa. Recentemente è stata pubblicata una metodologia efficiente per sintetizzare questi composti che descrive la sintesi in fase solida in quattro fasi anziché le cinque fasi precedentemente riportate. Il vantaggio di questa sintesi più breve è l’eliminazione dell’uso di reagenti tossici. La resina a base di linker Regenerating Michael (REM) a basso carico è risultata cruciale nella sintesi poiché le versioni ad alto carico hanno impedito l’aggiunta di reagenti contenenti ingombranti catene laterali feniliche e aromatiche. Il saggio colorimetrico 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) è stato utilizzato per esaminare la citotossicità delle concentrazioni micromolari di queste nuove molecole spirocicliche in vitro. MTT è prontamente disponibile in commercio e produce risultati relativamente veloci e affidabili, rendendo questo test ideale per questi eterocicli spirociclici. Sono state testate strutture ad anello ortogonali e furfurilammina (un precursore nel metodo di sintesi contenente un motivo ad anello simile a 5 membri).
Introduction
È noto che l’inibizione di piccole molecole dell’interazione dell’omologo doppio minuto 2 del topo ubiquitina-ligasi E3 (MDM2) con p53 ripristina l’induzione mediata da p53 dell’apoptosi delle cellule tumorali 1,2,3. MDM2 è un regolatore negativo della via p53 ed è spesso sovraespresso nelle cellule tumorali 4,5,6,7,8,9. Recenti studi cristallografici e biochimici hanno rivelato che piccole molecole contenenti una struttura spirociclica possono inibire efficacemente le interazioni MDM2-p5310. La struttura spirociclica (Figura 1, sfumata in blu) è considerata un motivo privilegiato in quanto la derivatizzazione di questo rigido sistema di anelli ortogonali ha portato alla scoperta di nuovi farmaci terapeutici. L’accesso a questa interessante architettura rappresenta una sfida quando si utilizzano tecniche di sintesi organica tradizionali. Sebbene siano stati studiati gli effetti terapeutici delle molecole spirocicliche nei sistemi biologici, la sintesi di queste molecole è ancora un processo ingombrante. I prodotti collaterali indesiderati, l’utilizzo di condizioni difficili e i metalli di transizione pericolosi sono spesso problematici.
Il potenziale uso del motivo spirociclico nello sviluppo di farmaci ha portato allo sviluppo di un protocollo che utilizza la sintesi in fase solida per generare una libreria di molecole con il motivo in aggiunta ad altri gruppi funzionali intercambiabili11,12. La separazione dei prodotti e dei reagenti tra le fasi potrebbe essere ottenuta semplicemente utilizzando un linker REM collegato a un cordone di resina e un contenitore filtrante in fase solida. Ciò ridurrebbe i passaggi e potenzialmente aumenterebbe i rendimenti. Questo approccio sintetico potrebbe produrre una vasta gamma di potenziali candidati farmaci. Tuttavia, l’efficacia di queste molecole in un sistema biologico richiederebbe ulteriori indagini.
Per determinare la citotossicità di questi composti spirociclici, è stato utilizzato il saggio MTT13,14. Questo metodo misura la vitalità cellulare e può essere utilizzato per determinare indirettamente la citotossicità cellulare. Diverse concentrazioni degli inibitori sono state aggiunte alle cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti e la proporzione di cellule viventi è stata misurata mediante analisi colorimetrica dell’entità della riduzione della MTT gialla da parte delle deidrogenasi mitocondriali al composto formazan viola (Figura 2). L’attività è più spesso riportata come un valore IC 50, la concentrazione alla quale la crescita cellulare è inibita del50% rispetto a un controllo non trattato. Questo articolo descrive il protocollo per il saggio MTT e i risultati preliminari di queste nuove molecole spirocicliche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sintesi dei composti spirociclici era basata su precedenti ricerche condotte da questo laboratorio, ma con alcune modifiche (Figura 1)11,12. L’avanzamento di ogni fase di reazione è stato monitorato mediante spettroscopia IR. Michael aggiunta del linker REM 1 con furfurilammina ha permesso di legare polimericamente 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Faculty Research Council a K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. sono destinatari della borsa di studio Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. e B.M.R. sono destinatari delle borse di ricerca STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Siamo grati al Dr. Matthew Berezuk e al Dr. Philip Cox per la guida sui saggi biologici.
Materials
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
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