Här beskriver vi en bioassay med användning av 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) för att testa tidigare syntetiserade spirocykliska oximer.
Spirocykliska heterocykler har nyligen rapporterats i litteraturen vara potentiella läkemedel för cancerbehandling. Syntesen av dessa nya ortogonala ringsystem är utmanande. En effektiv metod för att syntetisera dessa föreningar publicerades nyligen som beskrev den fasta fassyntesen i fyra steg snarare än de tidigare rapporterade fem stegen. Fördelen med denna kortare syntes är eliminering av användningen av giftiga reagenser. Låglastande regenererande Michael (REM) länkbaserat harts visade sig vara avgörande för syntesen eftersom höglastande versioner förhindrade tillsats av reagenser som innehöll skrymmande fenyl och aromatiska sidokedjor. Den kolorimetriska 3-(4′,5′-dimetyltiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen användes för att undersöka cytotoxiciteten hos mikromolära koncentrationer av dessa nya spirocykliska molekyler in vitro. MTT är lättillgängligt kommersiellt och ger relativt snabba, tillförlitliga resultat, vilket gör denna analys idealisk för dessa spirocykliska heterocykler. Ortogonala ringstrukturer samt furfurylamin (en föregångare i syntesmetoden innehållande ett liknande 5-manna ringmotiv) testades.
Småmolekylär hämning av interaktionen mellan E3 ubiquitin-ligas mus dubbel minut 2 homolog (MDM2) med p53 är känd för att återställa p53-medierad induktion av tumörcellsapoptos 1,2,3. MDM2 är en negativ regulator av p53-vägen och är ofta överuttryckt i cancerceller 4,5,6,7,8,9. Nya kristallografiska och biokemiska studier har visat att små molekyler som innehåller ett spirocykliskt ramverk effektivt kan hämma MDM2-p53-interaktioner10. Den spirocykliska ramen (figur 1, skuggad i blått) anses vara ett privilegierat motiv eftersom derivatisering av detta styva ortogonala ringsystem har lett till upptäckten av nya terapeutiska läkemedel. Att få tillgång till denna intressanta arkitektur utgör en utmaning när man använder traditionella organiska syntestekniker. Även om de terapeutiska effekterna av spirocykliska molekyler i biologiska system har undersökts, är syntesen av dessa molekyler fortfarande en besvärlig process. Oönskade sidoprodukter, med hårda förhållanden och farliga övergångsmetaller är ofta problematiska.
Den potentiella användningen av det spirocykliska motivet i läkemedelsutveckling ledde till utvecklingen av ett protokoll som använder fastfassyntes för att generera ett bibliotek av molekyler med motivet utöver andra utbytbara funktionella grupper11,12. Separationen av produkter och reaktanter mellan steg kan uppnås genom att helt enkelt använda en REM-länkare fäst vid en hartspärla och ett fastfasfilterkärl. Detta skulle minska stegen och potentiellt öka avkastningen. Detta syntetiska tillvägagångssätt skulle kunna ge upphov till ett stort antal potentiella läkemedelskandidater. Effektiviteten hos dessa molekyler i ett biologiskt system skulle dock kräva ytterligare undersökning.
För att bestämma cytotoxiciteten hos dessa spirocykliska föreningar användes MTT-analys13,14. Denna metod mäter cellviabilitet och kan användas för att indirekt bestämma cellcytotoxicitet. Olika koncentrationer av hämmarna tillsattes till odlade celler i en 96-brunnsplatta, och andelen levande celler mättes genom kolorimetrisk analys av omfattningen av reduktionen av gul MTT med mitokondriella dehydrogenaser till den lila formazanföreningen (figur 2). Aktiviteten rapporteras oftast som ett IC 50-värde – den koncentration vid vilken celltillväxt hämmas med50% i förhållande till en obehandlad kontroll. Detta dokument beskriver protokollet för MTT-analysen och de preliminära resultaten av dessa nya spirocykliska molekyler.
Syntesen av de spirocykliska föreningarna baserades på tidigare forskning utförd av detta laboratorium, men med vissa modifieringar (Figur 1)11,12. Förloppet för varje reaktionssteg övervakades med IR-spektroskopi. Michael tillägg av REM-länkaren 1 med furfurylamin som gav polymerbunden 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Från föregående r…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av ett bidrag från fakultetsforskningsrådet till K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. och J.F.M. är mottagare av Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. och B.M.R. är mottagare av STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Vi är tacksamma mot Dr. Matthew Berezuk och Dr. Philip Cox för vägledning om bioassays.
CELLS | |||
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
CHEMICALS | |||
1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas |
GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |