Summary

자연적으로 사이클링 마우스를 사용하는 자궁내막증의 신제닉 뮤린 모델

Published: November 24, 2020
doi:

Summary

자궁내막증의 많은 설치류 모델은 기술적 복잡성, 재현성 및/또는 면역 손상된 동물 또는 특수 리포터 마우스에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 우리는 독립적으로 검증 가능하고 객관적인 점수 매기기 시스템을 갖춘 실험용 마우스를 사용하여 병변 유도의 단순화 된 시스템을 제시하며, 난소 절제술 이나 생존 수술에 대한 요구 사항이 없습니다.

Abstract

자궁내막증은 골반 통증과 불임의 주요 원인입니다. 그것은 외피 위치에 자궁 내막 조직의 존재에 의해 정의된다. 자궁 내막증을 위한 새로운 치료 및 진단 공구의 발달은 질병을 공부에 있는 도전 때문에 부분적으로 제한되었습니다. 영장류 의 외부, 몇 포유동물 생리, 아무도 자발적인 자궁 내막증을 개발하지 않습니다. 설치류 모델은 인기가 있지만 많은 사람들이 면역 손상 된 마우스 또는 외과적으로 유도 된 질병을 활용하여 자궁 내막증의 인공 유도가 필요합니다. 최근에는 복막 주사와 관련된 모델에 더 많은 관심을 기울이고 있습니다. 기존 자궁내막증 모델의 여러 기능을 주관적인 채점 대신 미세한 정량화에 의존하는 새로운 단순화 된 시스템으로 통합하는 자궁 내막증의 뮤린 모델을 제시합니다. 이 모델에서는, 우리는 기증자 마우스의 호르몬 자극, 복막 주사, 체계적인 복부 조사 및 조직 수확, 및 부검 후에 언제든지 수행되고 검증될 수 있는 조직적 정량화를 능력을 발휘합니다. 이 모델에는 최소한의 리소스와 교육이 필요합니다. 뮤린 생존 수술이나 총 자궁 내막증 병변의 식별에 실험실 기술자에 의해 전문 지식을 필요로하지 않습니다; 면역 손상, 면역 무능, 및 돌연변이 마우스에서 사용할 수 있습니다. 안정적으로 인간 자궁 내막증 질환과 조직학적으로 일치하는 자궁 내막증 병변을 만듭니다.

Introduction

자궁내막증은 여성생식기관의수수께끼 질환으로, 여성1,2에상당한 재정적, 건강부담이 있다. 자궁내막증의 병인은 완전히 이해되지 않으며, 코엘로믹 대사증, 배아 뮐레리안 휴식, 골수 유래 전구세포의 모집, 역행 생리3을포함한 여러 가지 설명이 제안되었다. 이러한 제안된 기계장치의 다중 양상이 관련될 수 있고, 단 하나 설명이 질병의 모든 양식을 설명할 수 있는 동안, 자궁내막증 병인의 주요 모형은 역행생리입니다. 역행 생리는 나팔관을 통해 복막 구멍으로 생리 유출물의 통로입니다. 생리 여성의 90 %가 정기적으로 역행 생리4,5을겪는 것으로 추정됩니다. 역행 생리의 이 일반적인 현상을 감안할 때, 왜 자궁내막증은 여자의 부세트에서만 발전하는 것은불분명5. 이 질병의 병인학을 더 잘 이해하기 위해 직접적인 인간 연구는 실현 가능하지 않으며 동물 연구가 보증됩니다.

자궁내막증은 치료와 연구 모두에 도전이다. 질병의 보급은 알려지지 않았지만 10%1로추정된다. 자궁내막증의 몇몇 향상된 모형이 비침습적인 화상 진찰을 통해 정확하게 확인될 수 있는 동안, 결정적인 진단은 외과적으로 취득한 생검 견본의 조직병리학 분석을 통해서만 달성됩니다; 시각적으로 병에 걸린 것으로 보이는 병변은 실제로 다른 원인6에서 섬유증또는 흉터일 수 있다. 질병의 심각도 및 정도는 증상과 상관 관계가 없습니다7.

자궁내막증 병변은 마이크로환경 내에서 복잡한 방식으로 상호작용하는 이질성 세포 유형 및 집단으로 구성되므로, 따라서 세포모델의유용성을제한8,9. 생체 내에서 모델이 존재하지만, 이들은 고유의 도전과한계가 10,11,12. 영장류 모델은 이상적이지만종종13,14,15가가능하지 않습니다. 몇몇 비 영장류 포유동물은 생리하고 자발적으로 자궁내막증을개발16. 자궁 내막증의 설치류 모델은 존재하지만 각각은한계가 17. 이들 모델의 대부분은 기증자 수혜자 벽 또는 창자에 자궁내막 조직을 봉합하거나 이식하는 생존 수술을 요구하며, 기술적 복잡성을 추가하고 마취가 필요하며 수술 자체로부터 면역 인자를혼동18,19,20. 또한, 많은 모델 은 ovariectomy 및 에스트로겐 보충을 필요로; 병변 수율을 증가하는 동안, 이것은 시간, 비용 및 추가 생존 수술을 추가합니다. 인트라피오날(IP) 주사 모델은 마취 또는 생존 수술을 필요로 하지 않으며, 이들 모델은 논리적으로 역행 생리를 시뮬레이션하여 모델을 봉합하는모델(21,22,23)보다더 잘 한다. 그러나 대부분의 IP 모델은 주입 후 자궁내막 단편의 무작위 분산으로 인해 병변 위치에서 더 많은 가변성을 가지므로 병변 식별 및 측정에 더 많은 편견이 있습니다.

여기서 우리는 주관적인 채점 대신 현미경 정량화에 의존하는 새로운, 단순화되고 효율적인 시스템으로 기존 자궁 내막증 모델의 여러 기능을 통합하는 자궁 내막증의 뮤린 모델을 제시합니다.

Protocol

참고 : 이 연구에서 동물의 사용은 클리블랜드 클리닉 러너 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 공개적으로 이용 가능한 모든 동물 관리 및 사용 기준은 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 절차는 무균 기술을 활용하고 있습니다. 페트리 접시는 멸균입니다. 사용되는 PBS/식염수는 멸균입니다. 부검 및 조직 해부에 대한 수술 기구는 오토 클레이브를 ?…

Representative Results

개념 실험의 초기 증거를 위해, RFP 마우스에서 기증자 내메트리움은 야생 형 받는 사람 마우스로 주입되었다. H&E 염색은 자궁내막증 병변의 고전적인 건축에 대한 조직병리학적 확인을공개했다(그림 3A). 형광 현미경 검사는 문제의 관찰 된 병변이 기증자(도 3B)로부터유래것을 확인했다. 두 번째 실험은 10개의 야생형 C57BL/6J 기증자…

Discussion

우리의 연구는 자궁 내막증이 난소 절제술 및 / 또는 생존 수술의 사용을 요구하지 않고 마우스에서 안정적으로 유도 될 수 있음을 보여 주며, 자궁 내막 병변은 복부 및 역사학 분석의 표준화 된 설문 조사를 사용하여 식별하고 정량화 할 수 있음을 보여줍니다.

자궁내막증의 많은 뮤린 연구는 기증자 자?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 원고를 준비하는 동안 중요한 검토와 통찰력에 대한 Reizes 실험실의 구성원뿐만 아니라 데이터 수집 및 데이터 분석에 대한 지원을 Lerner 연구소의 이미징 및 히스토로지 코어에 감사드립니다. 이 사업은 클리블랜드 클리닉의 연구 프로그램 위원회를 통해 내부 보조금 기금을 통해 지원되었으며 생식 조사 및 바이엘 협회를 통한 외부 보조금으로 지원되었습니다. Reizes 실험실에 있는 연구는 또한 치료벨로사노 자전거를 통해 투자됩니다, 부인과 암에 있는 연구 우수성의 센터, 그리고 Uterine 암 연구를 위한 로라 J. Fogarty 부여 의자를 통해. 클리블랜드 클리닉은 그림 1그림 2에대한 저작권 권한을 소유하고 있습니다.

Materials

Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle Fisher Scientific 14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma-Aldrich 9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip Electron Microscopy Sciences 72993-6C
70% ethanol solution Pharmco 33000HPLCCS4L 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance Mettler Toledo ME54TE
Carbon dioxide TriGas Supplier
Dissecting tray Fisher Scientific S14000
No. 10 disposable scalpel Fisher Scientific NC9999403
Scissors, curved Electron Microscopy Sciences 72941
Scissors, straight Electron Microscopy Sciences 72940
Stereo microscope Leica Microsystems Leica SE 4 For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS) Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray Electron Microscopy Sciences 66112-02
Tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772E
Weighing dishes Fisher Scientific 02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe BD Biosciences 301025
18 G needle Fisher Scientific 148265d
200 uL pipette tip Fisher Scientific 02-707-422
Double distilled water Institutional core facility supplies
Latex bulb Fisher Scientific 03-448-21
Micro cover glass slip VWR 48366-067
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-7
Standard light microscope Leica Microsystems DM IL For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin Fisher Scientific SF100-4
Biopsy foam pads Fisher Scientific 22-038-222
Precision Digital Calipers Electron Microscopy Sciences 62065-40
Processing/embedding cassettes Fisher Scientific 22-272416

References

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Richards, E. G., Rehmer, J. M., Mathes, M. A., Esakov, E. L., Braley, C., Joehlin-Price, A., Chiesa-Vottero, A., Reizes, O. A Syngeneic Murine Model of Endometriosis using Naturally Cycling Mice. J. Vis. Exp. (165), e61960, doi:10.3791/61960 (2020).

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