Un modello murino singenico di endometriosi utilizzando topi naturalmente ciclabili
Summary
Molti modelli di endometriosi di roditori sono limitati dalla complessità tecnica, dalla riproducibilità e / o dalla necessità di animali immunocompromessi o topi reporter speciali. Presentiamo un sistema semplificato di induzione della lesione utilizzando qualsiasi topo sperimentale con un sistema di punteggio oggettivo verificabile in modo indipendente e senza necessità di ovariectomia o chirurgia di sopravvivenza.
Abstract
L’endometriosi è una delle principali cause di dolore pelvico e infertilità. È definito dalla presenza di tessuto endometriale in posizioni extrauterine. Lo sviluppo di nuove terapie e strumenti diagnostici per l’endometriosi è stato limitato a causa in parte delle sfide nello studio della malattia. Al di fuori dei primati, pochi mammiferi hanno le mestruazioni e nessuno sviluppa endometriosi spontanea. I modelli di roditori sono popolari ma richiedono l’induzione artificiale dell’endometriosi, con molti che utilizzano topi immunocompromessi o malattie indotte chirurgicamente. Recentemente, è stata data maggiore attenzione ai modelli che coinvolgono l’iniezione intraperitoneale. Presentiamo un modello murino di endometriosi che integra diverse caratteristiche dei modelli di endometriosi esistenti in un nuovo sistema semplificato che si basa sulla quantificazione microscopica al posto della classificazione soggettiva. In questo modello, eseguiamo la stimolazione ormonale dei topi donatori, l’iniezione intraperitoneale, l’indagine addominale sistematica e la raccolta dei tessuti e la quantificazione istologica che può essere eseguita e verificata in qualsiasi momento dopo l’autopsia. Questo modello richiede risorse e formazione minime; non richiede competenze da parte di tecnici di laboratorio nella chirurgia murina di sopravvivenza o nell’identificazione di lesioni endometriotiche grossolane; può essere usato in topi immunocompromessi, immunocompetenti e/o mutanti; e crea in modo affidabile lesioni endometriotiche che sono istologicamente coerenti con la malattia endometriotica umana.
Introduction
L’endometriosi è una malattia enigmatica del tratto riproduttivo femminile con significativi oneri finanziari e sanitari per le donne1,2. L’eziologia dell’endometriosi non è completamente compresa e sono state proposte molteplici spiegazioni tra cui metaplasia celomica, riposi mülleriani embrionali, reclutamento di cellule progenitrici derivate dal midollo osseo e mestruazioni retrograde3. Mentre possono essere coinvolti molteplici aspetti di questi meccanismi proposti, e nessuna singola spiegazione può spiegare tutte le forme della malattia, il modello principale di patogenesi dell’endometriosi è la mestruazione retrograda. Le mestruazioni retrograde sono il passaggio dell’effluente mestruale attraverso le tube di Falloppio e nella cavità peritoneale; si stima che il 90% delle donne mestruazioni si sottoponga regolarmente a mestruazioni retrograde4,5. Dato questo fenomeno comune delle mestruazioni retrograde, perché l’endometriosi si sviluppa solo in un sottogruppo di donne non è chiaro5. Per comprendere meglio l’eziologia di questa malattia, gli studi diretti sull’uomo non sono fattibili e gli studi sugli animali sono giustificati.
L’endometriosi è una sfida sia da trattare che da studiare. La prevalenza della malattia non è nota ma stimata in 10%1. Mentre alcuni tipi avanzati di endometriosi possono essere identificati con precisione attraverso l’imaging non invasivo, una diagnosi definitiva si ottiene solo attraverso l’analisi istopatologica di campioni di biopsia ottenuti chirurgicamente; lesioni che visivamente sembrano essere malate, possono infatti essere fibrosi o cicatrici da altre cause6. La gravità e l’estensione della malattia non sono correlate alla sintomatologia7.
Le lesioni dell’endometriosi sono costituite da tipi cellulari eterogenei e popolazioni che interagiscono in modi complessi all’interno del microambiente, limitando quindi l’utilità dei modelli cellulari8,9. Esistono modelli in vivo, ma questi hanno sfide e limitazioni intrinseche10,11,12. I modelli di primati sono ideali ma spesso non sonofattibili13,14,15. Pochi mammiferi non primati hanno le mestruazioni e sviluppano l’endometriosi spontaneamente16. Esistono modelli di roditori di endometriosi, ma ognuno ha limitazioni17. Molti di questi modelli richiedono un intervento chirurgico di sopravvivenza per suturare o impiantare il tessuto endometriale nella parete o nell’intestino del ricevente donatore, aggiungendo complessità tecnica, necessità di anestesia e confondendo i fattori immunitari dell’intervento stesso18,19,20. Inoltre, molti modelli richiedono l’ovariectomia e l’integrazione di estrogeni; mentre aumenta la resa della lesione, questo aggiunge tempo, spese e ulteriori interventi chirurgici di sopravvivenza. I modelli di iniezione intraperitoneale (IP) non richiedono anestesia o chirurgia di sopravvivenza e questi modelli simulano logicamente le mestruazioni retrograde meglio dei modelli di sutura21,22,23. La maggior parte dei modelli IP, tuttavia, sono soggetti a una maggiore variabilità nella posizione della lesione a causa della dispersione casuale dei frammenti endometriali dopo l’iniezione e quindi a una maggiore distorsione nell’identificazione e nella misurazione delle lesioni.
Qui presentiamo un modello murino di endometriosi che integra diverse caratteristiche dei modelli di endometriosi esistenti in un sistema nuovo, semplificato ed efficiente che si basa sulla quantificazione microscopica al posto della classificazione soggettiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro studio dimostra che l’endometriosi può essere indotta in modo affidabile nei topi senza richiedere l’uso di ovariectomia e / o chirurgia di sopravvivenza e che le lesioni endometriali ectopiche possono essere identificate e quantificate utilizzando un’indagine standardizzata dell’addome e un’analisi istologica.
Molti studi murini di endometriosi utilizzano l’endometriosi indotta chirurgica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Reizes per la loro revisione critica e le intuizioni durante la preparazione del manoscritto, così come i nuclei di imaging e istologia del Lerner Research Institute per la loro assistenza nella raccolta e nell’analisi dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto attraverso un finanziamento interno attraverso il Comitato del programma di ricerca presso la Cleveland Clinic e da una sovvenzione esterna attraverso la Society for Reproductive Investigation e Bayer. La ricerca nel Laboratorio Reizes è finanziata anche attraverso VeloSano Bike to Cure, Centro di eccellenza della ricerca nel cancro ginecologico, e attraverso la Laura J. Fogarty Endowed Chair for Uterine Cancer Research. La Cleveland Clinic possiede l’autorizzazione di copyright per la Figura 1 e la Figura 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A. Endometriosis. England Journal of Medicine. 382 (13), 1244-1256 (2020).
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C. Clinical practice. Endometriosis. New England Journal of Medicine. 362 (25), 2389-2398 (2010).
- D’Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R. Clinical management of endometriosis. Obstetrics and Gynecology. 131 (3), 557-571 (2018).
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al. Endometriosis. Endocrine Reviews. 40 (4), 1048-1079 (2019).
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women’s Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
